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世界华人消化杂志. 2004-01-15; 12(1): 149-151
在线出版日期: 2004-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i1.149
丙型肝炎病毒与PKR信号转导系统
杨倩, 成军, 刘妍, 洪源, 王建军, 党晓燕, 张树林
杨倩, 成军, 刘妍, 洪源, 王建军, 党晓燕, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-06-24
修回日期: 2003-07-01
接受日期: 2003-07-16
在线出版日期: 2004-01-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 杨倩, 成军, 刘妍, 洪源, 王建军, 党晓燕, 张树林. 丙型肝炎病毒与PKR信号转导系统. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 149-151
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: June 24, 2003
Revised: July 1, 2003
Accepted: July 16, 2003
Published online: January 15, 2004

N/A

Key Words: N/A
0 引言

在病毒感染真核细胞的过程中, 干扰素(IFN)诱导细胞的抗病毒机制是机体防御感染的第一道防线. 在病毒感染过程中, 分泌的干扰素主要用于保护邻近细胞免受感染, 限制病毒扩散[1]. Ⅰ型IFN由IFN-α、IFN-两种亚型组成, IFN-α主要由白细胞分泌产生, IFN-主要由成纤维细胞、上皮细胞产生. Ⅰ型IFN与相应的受体结合, 激活信号级联反应, 从而调节至少30个基因的转录翻译水平, 其中包括双链RNA激活的蛋白激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase, PKR)和２'-5'寡聚腺苷酸合成酶(２'-5'oligoadenylates synthesis), 这两种酶的激活均需要病毒复制过程中产生的双链RNA[2,3]. PKR参与机体的抗病毒机制, 与细胞凋亡密切相关, 从而受到越来越多的关注.

1 PKR的结构与生物学特点

PKR是经典的IFN诱导产物, 参与IFN的抗病毒机制. PKR又称为DAI或p68,由551个氨基酸残基组成,其N端为调节区(1-265 aa), 具有两个与dsRNA结合的部位, 分别位于55-75 aa及145-166 aa区域内, 其中前一个区域是必需的; 其C端(266-551 aa)为催化部位. PKR分子量为68 kDa, 属于保守双链RNA结合分子家族, 该家族还包括大肠杆菌RNA酶III等[4]. Jiménez-García et al[5]通过比较腺病毒2感染和未感染的HeLa细胞发现, 在未感染的细胞中PKR分布在细胞质, 同时也发现PKR在核浆中也有散在分布, 感染细胞与未感染细胞有相似的细胞分布. 研究表明低浓度的dsRNA具有激活作用, 然而高浓度的dsRNA却阻止该活化作用. 目前认为dsRNA对PKR的激活与双链RNA长度有关, 而与序列结构无关, 激活PKR最少需要30 bp dsRNA, 随着dsRNA的延长激活能力逐渐增强. 但有学者发现含有双链长度不超过20 bp的单链Tm1-3RNA亦能激活PKR, 提示PKR的激活可能存在多种形式. PKR与dsRNA结合后, 形成二聚体, 随后进入自主磷酸化和随后的不依赖dsRNA的底物磷酸化, PKR的N端有两个保守的dsRNA结合基点(motif), 第一个基点含有与dsRNA结合的高度保守性氨基酸序列; C端为催化活性结构域, 但这一活性在dsRNA结合前是封闭的, 当N端基点上结合dsRNA后, 可能通过蛋白质构型的改变, 使C端的酶活性表现出来[6-10].

活化的PKR能够识别蛋白质合成的起始因子真核翻译起始因子-2(eukaryotic initiation factor-2, eIF-2), 并使eIF-2的α亚基51位丝氨酸磷酸化. 异源二聚体的eIF-2能够结合GTP和tRNA, 形成三元复合物. 该复合物与40 s核糖体亚单位结合形成一个43 s的复合物[11]. 43 s的聚合物参与识别mRNA起始密码子, 结合60 s核糖体亚单位同时伴随GTP的水解转变为GDP. 在下一个同样的循环开始前, 与eIF-2结合的GDP在eIF-2B催化作用下由GTP替代. eIF-2α亚基51位丝氨酸磷酸化将大大提高GDP对eIF-2的亲和性, 使GDP与GTP的交换受到阻滞. 虽然eIF-2-GDP与eIF-2B能够形成稳定复合物, 但由于在细胞中eIF-2的含量远远高于eIF-2B, 因此比例较少的eIF-2磷酸化即可阻断细胞中eIF-2B的催化作用. PKR催化eIF-2α51位苏氨酸磷酸化, 改变eIF2功能, 阻止eIF2B发挥作用, 从而降低eIF2-GTP的水平, 使蛋白合成和病毒复制水平下降[12-15].

最近研究还发现在肿瘤坏死因子-α、dsRNA、病毒感染等刺激下, 激活的PKR可以诱发凋亡. 这一发现提示PKR除了阻断病毒蛋白合成外, 还可以通过诱发凋亡发挥抗病毒作用. PKR诱发凋亡机制与其磷酸化eIF-2α、激活NF-B和p53有关[16-18]. 实验发现: 表达51 aa发生丝氨酸→丙氨酸替换的eIF-2α变异体的NIH3T3细胞可以抵抗血清缺失和肿瘤坏死因子-α诱导的凋亡[19]; 在HeLa细胞中同样变异体的表达亦可保护细胞由PKR大量表达诱发的凋亡[20]; 51 aa发生丝氨酸→天冬氨酸替换的eIF-2α变异体功能与磷酸化eIF-2α相似, 表达该变异体的COS-1细胞可以诱导凋亡发生[21]. 这些研究结果显示eIF-2α可以直接诱发凋亡产生. 机制可能与磷酸化eIF-2α诱导一些与凋亡相关的mRNA优先表达相应蛋白有关, 这与酿酒酵母氨基酸缺乏反应相似, Bcl-2家族中的Bax的表达可能与此有关[22]. 此外, PKR还可以激活与炎症、凋亡密切相关的NF-B、p53及IRF1. NF-B异源二聚体与Ib结合时处于无活性状态, 当与激活因子发生反应时, 磷酸化Ib发生遍在蛋白依赖的蛋白酶体降解, 使得NF-B转位核内. PKR在细胞内促使Ib磷酸化和激活NF-B, 目前认为是通过直接磷酸化Ib磷酸激酶复合物而发挥作用, 缺乏PKR的细胞不能对dsRNA产生抑制[23-25].

PKR可以激活p53, 具体机制尚不明确, PKR磷酸化p53蛋白392位丝氨酸可能与其调节p53功能有关, 在缺乏PKR的细胞p53的功能受到损伤.

2 PKR与丙型肝炎的关系

在病毒感染机体的过程中, 病毒常常发生变异抵抗PKR介导的抗病毒机制, 主要表现为以下几种方式: (1)产生拮抗dsRNA的RNA或蛋白, 阻止PKR的活性; (2)产生dsRNA结合蛋白, 隔离与PKR结合; (3)产生蛋白阻止PKR二聚体化; (4)产生蛋白干扰PKR与eIF2的结合; (5)激活磷酸酶使PKR和eIF2去磷酸化; (6)阻止PKR的表达或诱导PKR降解[26-28].

丙型肝炎病毒(HCV)属黄病毒属家族, 可引起机体的持续性感染, 导致慢性肝炎和肝硬化, 并与肝细胞癌、淋巴细胞增生紊乱密切相关. 目前惟一有效的治疗途径是运用干扰素, 但是大多数患者对治疗无明显反应[29-31]. 其中病毒发生变异逃避PKR抗病毒作用, 是其抵抗干扰素治疗的主要机制之一. NS5A和E2两种蛋白参与调节机体对dsRNA的反应, 研究表明这两种蛋白能够与PKR结合, 并阻止其发挥抗病毒作用. 同时分子流行病学研究发现NS5A或 E2序列, 特别是与PKR结合的区域, 与病毒的持续感染、对干扰素治疗的反应有紧密的联系[32]. 这些发现表明病毒的持续感染机制之一, 可能与NS5A和E2阻止激活的PKR引发的抗病毒作用有关. E2是病毒的包膜蛋白, 参与病毒与靶细胞的结合, 在丙肝病毒不同株之间E2具有高变的特点, Taylor et al[33]研究E2在干扰素抵抗中的作用发现, 来自不同病毒分离株E2均含有一个12氨基酸的序列, 该序列与PKR 自磷酸化位点、eIF2磷酸化位点相似, 该序列在不同株之间高度保守. 实验证实PKR与E2能够在体外结合, 体内、外实验均证实E2可以阻断PKR的活性; Pflugheber et al[34]构建包含HCV复制子的Huh7细胞系, 将其中一个命名为10A, 包含的病毒复制子编码氨基酸(aa)序列中于2 040位插入赖氨酸, 该位点靠近的氨基末端; 另一个命名为H27, 包含的病毒复制子于2 198位发生亮氨酸(L)与丝氨酸(S)的替换, 该位点邻近PKR结合区域; 细胞培养结果表明10A复制水平超过H27的５倍. 为了进一步明确病毒复制水平与NS5A、PKR之间的关系, Pflugheber et al利用免疫共沉淀技术发现与Huh7细胞相比, H27细胞产生的PKR水平升高显著; 当在这两种细胞系中加入dsRNA后, PKR的活性明显升高; 而在10A细胞系中PKR呈现出低度的活性, 对dsRNA刺激无明显反应, 当加入NS5A抗体后PKR活性恢复. PKR与NS5A在10A细胞中的亚细胞定位相互重叠, 而在H27细胞中却无此现象出现. 由此研究者认为由10A细胞病毒复制子编码的NS5A能够与PKR结合并且抑制其活性. 同时研究者也注意到在两种不同的病毒复制子中都包含有64个aa组成的PKR结合域, 但发生L2198S替换或其他紧邻PKR结合区域的aa替换, 可能会改变NS5A对PKR结合、调节.

PKR的激活在不同的病毒、不同的宿主之间将产生截然不同的结果. 进一步对PKR作用机制及其信号传导通路的研究, 明确其抗病毒的具体机制, 为发展新的治疗策略提供新的方向.

编辑: N/A

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