胃癌 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2004. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2004-01-15; 12(1): 13-15
在线出版日期: 2004-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i1.13
mRNA致敏树突细胞对胃癌的免疫治疗作用研究
罗治彬, 徐采朴, 朱高友, 张朋斌, 郭朝华, 罗元辉, 房殿春, 罗成基
徐采朴, 罗元辉, 房殿春, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化内科中心 重庆市 400038
罗治彬, 中国人民解放军第三军医大学大坪医院肿瘤中心 重庆市 400042
朱高友, 重庆市垫江高安中心医院 重庆市 408306
张朋斌, 中国人民解放军第三军医大学新桥医院消化内科 重庆市 400037
郭朝华, 罗成基, 中国人民解放军第三军医大学全军复合伤研究所 重庆市 400038
罗治彬, 男, 1968-06-13生, 重庆市垫江县人, 汉族. 2000年第三军医大学博士研究生毕业, 讲师. 主要从事胃肠黏膜免疫和肿瘤免疫防治方面的研究, 已发表论文26篇.
通讯作者: 罗治彬, 400042, 重庆市渝中区大坪长江支路10号, 中国人民解放军第三军医大学大坪医院肿瘤中心. luozhibin@online.cq.cn
电话: 023-68757346
收稿日期: 2003-04-15
修回日期: 2003-05-25
接受日期: 2003-06-02
在线出版日期: 2004-01-15

目的: 了解DC在胃癌胃黏膜中的功能状态, 探讨DC用于胃癌等实体瘤防治的可能性, 旨在为胃癌的治疗探索一条新的途径.

方法: 利用致敏DC治疗胃癌, 以观察其对荷胃癌小鼠的免疫治疗效果.

结果: 荷胃癌小鼠经胃癌细胞RNA致敏的DC治疗后, 小鼠腹水产生率、肿瘤转移率、动物的存活率、平均瘤体质量等指标分别为75% (6/8)、25% (2/8)、75% (6/8)、(2.04±0.33 g), 均优于对照组(P<0.01); 局部组织中IL-12、IL-18和IFN 的基因表达水平都明显升高(P<0.01); 肿瘤局部CD4+、CD8+细胞数量分别为0.71±0.25/m2和0.67± 0.22/m2, P<0.05), TIL细胞毒活性明显增强.

结论: 胃癌RNA致敏的DC, 能促进胃癌抗原的提呈并启动和增强局部的抗瘤免疫功能, 改善临床症状和生存质量, 对荷胃癌小鼠具有一定的免疫治疗效果.

关键词: N/A
引文著录: 罗治彬, 徐采朴, 朱高友, 张朋斌, 郭朝华, 罗元辉, 房殿春, 罗成基. mRNA致敏树突细胞对胃癌的免疫治疗作用研究. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 13-15
Immunotherapy of dendritic cells transfected with mRNA of gastric cancer cells in carried-tumor mice
Zhi-Bin Luo, Cai-Pu Xu, Gao-You Zhu, Peng-Bin Zhang, Chao-Hua Guo, Yuan-Hui Luo, Dian-Chun Fang, Cheng-Ji Luo
Cai-Pu Xu, Yuan-Hui Luo, Dian-Chun Fang, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Chongqing 400038, China
Zhi-Bin Luo, Department of Oncology, The 3th Affiliated Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China
Gao-You Zhu, Department of Gastroenterology, Gaoan Center Hospital, Dianjiang County, Chongqing 408306, China
Peng-Bin Zhang, Department of Gastroenterology, Xinqiao Hospital, Chongqing 400037, China
Chao-Hua Guo, Cheng-Ji Luo, Department of Radiation Medicine, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Correspondence to: Dr. Zhi-Bin Luo, Department of Oncology, The 3th Affiliated Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China. luozhibin@online.cq.cn
Received: April 15, 2003
Revised: May 25, 2003
Accepted: June 2, 2003
Published online: January 15, 2004

AIM: To probe into the possibility of dendritic cells (DC) in preventing solid carcinomas such as gastric cancer (GC).

METHODS: Immunotherapy was proformed by DC sensitized by mRNA of gastric cancer cells.

RESULTS: The indices such as the production rate of ascites of mice (75%), the metastasis rate of tumor (25%), the survival rate of animals (75%) and the average weight of tumor (2.04±0.33 g) showed that the condition of the mice treated by DC was better than that in the control group (P< 0.01). And the level of gene expression of IL-12, IFN and IL-18 in local tumor tissue was significantly raised (P < 0.01) and the amount of local CD4+ (0.71±0.25/m2) and CD8+ (0.67±0.22/m2) cells was increased (P < 0.05) and the cytotoxicity of TIL was remarkably enhanced.

CONCLUSION: DC transfected with mRNA isolated from mouse tumor cells may effectively control the growth of tumor and ameliorate the symptoms, suggesting that a certain therapeutic efficiency for mice carrying tumor can be realized.

Key Words: N/A
0 引言

树突状细胞(dendritic cell, DC)是体内最有效的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell), 是T细胞依赖性免疫应答的重要辅助细胞[1-3]. 癌前状态胃黏膜中DC数量显著增多, 功能增强; 而胃癌患者胃黏膜中肿瘤浸润性树突状细胞(tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)数量随分化程度的降低而减少, TIDC提呈胃癌抗原引起宿主免疫抵抗的能力较弱, 胃黏膜中DC细胞功能的抑制是导致胃黏膜免疫功能低下和癌前状态发生癌变的重要原因之一[4-8]. 因此, 我们利用致敏DC对荷胃癌小鼠的免疫治疗效果如下.

1 材料和方法
1.1 材料

60Co射线放射源, 本院放射科提供; 台式低温冷冻离心机, MR1812, Jouar公司生产, USA; PCR循环仪, 2400型, Perkin-Eler生产; 凝胶成像仪, Gel Doc 2000型, Bio-Rad生产, USA; 图像分析仪, Tiger920型, Germany生产. 小鼠的前胃癌细胞MFC(mouse forestomach carcinoma) 细胞系: 从中国科学院上海细胞所引进; IFN、IL-18 primer: 上海生工生物工程公司合成; Cytotoxicity Detection Kit (LDH)和Lipotectimin: 脂质体(DOTAP), 宝灵曼公司生产, Germany; Purified Rat anti-mouse CD8 α(Ly-2) mAb: cat#01041D, Phamingen公司生产; Access RT-PCR System: cat# A1250, Promega公司生产. 615小鼠, SPF级, 购自第三军医大学实验动物中心(川实动管使第015号, 川实动管质第058号), 6-8周龄, 雌雄各半, 体重为23.2±1.5 g, 随机分为分3组: RNA-DC、PBS、灭活MFC, 每组8只, 各组间质量无统计学差异.

1.2 方法

采用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子从小鼠骨髓的CD34+细胞中扩增、分离出大量纯化DC. 选用生长期小鼠的前胃癌细胞系MFC细胞, 加入TripureTM分离试剂按其说明书进行RNA提取分离操作, 取样品适当稀释, 用紫外分光光度计定量后备用. 从小鼠骨髓的CD34+细胞中扩增、分离出大量纯化DC, 在15 mL的聚丙烯试管中洗涤DC 2次、重悬, 细胞密度调为5.0×109/mL, 移入另一支15 mL聚苯乙烯试管中; 将25 g MFC RNA (250 L)与50 g 脂质体 (250 L, 培养基配制)混匀, 20 ℃孵育10 min; 将上述混合物加入5.0×109/mL DC中37 ℃培养40 min (间断晃动). 洗涤后重悬于无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中(2.0×108/mL), 3 000 cGy灭活备用.

1.2.1 MFC RNA冲击DC对小鼠的免疫治疗作用: 各组615小鼠腋窝皮下注射2×108/mL MFC 500 L/鼠; 第7 d分别给各组615小鼠腹腔注射已制好的3 000 cGy灭活MFC RNA致敏DC (RNA-DC组)、PBS(PBS组)、3 000 cGy灭活的2×108/mL MFC (灭活MFC组)各500 L/鼠; 第3 d后复种1次, 以后每天观察小鼠肿瘤的生长情况及其存活率; 第21 d处死小鼠, 取肿瘤组织分离肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)以检测其细胞毒活性; 取肿瘤组织分别进行CD4+, CD8+细胞的免疫组化染色、用RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)和原位杂交染色检测细胞因子IL-12, IL-18, IFN.

1.2.2 细胞毒活性检测: 无菌条件下将新鲜肿瘤组织剪碎、匀浆、过滤、离心, 不连续密度梯度离心, 收集界面细胞用RPMI 1640培养液调浓度为1×109/mL, 加入rIL-2 100 KU/mL在50 mL/L CO2 37 ℃培养, 每天观察1次, 每3 d换液1次(当细胞密度大于2×109/mL时补充rIL-2并调整细胞浓度); 用前500 g离心3 min, 生理盐水洗涤1次, TIL计数后备用. 按说明书进行细胞毒活性检测操作, 设孔: 效-靶细胞混合物(effector-target cell mix, E-T)及效应细胞(effector cell, EC)各12孔, 另设背景对照、自发(Low)对照、最大释放(High) 对照, 分别设3个复孔; ELISA机测读A490 nm值. 细胞介导的细胞毒活性(%) = [(效-靶细胞混合物－背景对照)-自发对照]÷(最大释放对照-自发对照) ×100%.

1.2.3 RT-PCR、SP法免疫组化染色和原位杂交: 根据基因库GenBank (htlp://http://www.ncbi.nih.gov/entrez/necleotide.htlm)中小鼠IL-18, IFN 的完整cDNA序列, 利用PRIMER软件设计PCR成对引物. IL-18: 上游引物5'-ACTGTACAACCGCAGTAATAC-3', 下游引物5'-AGTGAACATTACAGA T TTATCCC-3'(扩增产物片段长度434 bp、退火温度56 ℃); IFN: 上游引物5'-AACGCTACACACTGCATCTTGG-3', 下游引物5'-GACTTCAAAGA GTCTGAGG -3'(扩增产物片段长度237 bp、退火温度56 ℃). 在PCR管中加入: 5×buffer 5.0 L、dNTP 2.0 L、ddH2O(DEPC) 11 L、specific Primer 1.5 L、GAPDH Primer 1.5 L、MgC12 1.0 L、Totel RNA 2.0 L、AMV 0.5 L、Tf1 DNA 0.5 L (Totel 25 L), 48 ℃ 45 min; 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 40 s, 退火 40 s, 68 ℃ 120 s, 35 个循环, 68 ℃ 10 min; 20 g/L琼脂糖电泳后凝胶照像记录. 免疫组化和原位杂交染色按文献[7,9]介绍方法进行.

统计学处理 采用第三军医大学数学教研室编制的数理统计程序包作单因素方差分析、二维列联表统计, 结果以mean±s表示, P<0.05为相差显著.

2 结果

RNA-DC组小鼠经治疗后肿瘤生长相对减慢, 未见大范围的转移, 腹水量少, 动物精神状况稍有好转. 而PBS组小鼠虽经治疗, 但肿瘤生长仍然很快, 精神食欲很差, 嗜睡, 不活动, 动物明显衰竭; 全身皮下可见大小不等的多个转移灶和新旧不一的出血斑, 腹水明显、呈蛙腹状. 灭活MFC组介于二者之间(表1).

表1 小鼠肿瘤的生长情况及其存活率(mean±SD, n = 8).
项目RNA-DC组PBS组灭活 MFC组
瘤体质量(g)2.04±0.33a4.71±0.774.96±0.58
转移率25% (2/8)b100% (8/8)100% (8/8)
腹水率75% (6/8)100% (8/8)100% (8/8)
生存率75% (6/8)b37.5% (3/8)50% (4/8)b
aP<0.05,
bP<0.01 vs PBS组.
2.1 肿瘤TIL细胞毒活性检测

RNA-DC组的细胞毒活性明显高于相同效靶比的PBS组(表2, P<0.05或P<0.01).

表2 各组肿瘤TIL细胞毒活性的检测结果(mean±SD,%).
效-靶比PBS组MFC组RNA-DC组
0.392.00±0.135.80±1.6011.59±2.98
0.783.60±1.018.00±4.2215.30±4.28a
1.564.70±2.1811.80±2.8221.30±6.55a
3.1256.00±3.1115.80±5.1730.00±4.17a
6.259.00±6.1020.70±4.1038.00±8.42a
12.511.50±2.4827.60±7.1848.30±6.75b
2515.10±6.1035.10±6.41a59.00±7.44b
5018.30±2.0740.90±5.74a68.50±9.83b
10020.80±3.5543.00±5.00a70.50±14.29b
aP<0.05,
bP<0.01 vs PBS组.
2.2 免疫组化、原位杂交染色和RT-PCR

PBS组CD4+ 细胞数为0.18±0.01/m2、CD8+ 细胞数为0.21±0.06/m2, MFC组CD4+, CD8+细胞数分别为0.37±0.18/m2和0.34±0.17/m2, 与PBS组无显著差异(P>0.05). RNA-DC组CD4+、CD8+细胞数量分别为0.71±0.25/m2和0.67±0.22/m2, 均明显高于PBS组(P<0.05); 而各组平均吸光度则无显著差异(P>0.05). RNA-DC组IL-12 p40 mRNA阳性产物的面积比率显著高于PBS组(P<0.01); 而其阳性产物的平均吸光度与PBS组均无差异(P>0.05). RNA-DC组IL-18 mRNA、IFN mRNA阳性产物的平均吸光度显著高于PBS组 (P<0.05); 而灭活MFC组与PBS组相比则无差异(P>0.05).

3 讨论

胃癌发病率高, 其免疫治疗在国内外已经有不少研究[10-21]. 我们发现,胃癌细胞RNA致敏的DC接种后, 局部肿瘤组织中IL-12 , IL-18和IFN等因子的基因表达水平都有明显的升高, TIL细胞在致敏DC的诱导下其细胞毒活性均有了明显增强(并且其细胞毒活性随着效靶细胞比值的增加而增加); 小鼠的精神食欲状况、腹水的产生、肿瘤生长和转移的发生率、动物的存活率和瘤体的重量等指标均优于各自的对照组小鼠. 表明RNA致敏DC接种后, 由于促进了胃癌抗原的有效提呈, 并在自身和周围组织分泌的细胞因子IL-12、IL-18和IFN作用下, CD4+, CD8+细胞活化, 使局部肿瘤组织中NK、TIL等效应细胞的细胞毒活性和抗体产生细胞功能增强. RNA-DC接种后, 肿瘤局部CD4+、CD8+细胞的数量有一定程度的增加, 局部肿瘤组织中TIL细胞的细胞毒活性增强. 说明DC诱导的免疫应答与CD4+、CD8+ T细胞密切有关. Boczkowski et al[22-23]研究也发现RNA抗原比肿瘤洗脱肽抗原能更高效地致敏DC, 用含OVA抗原的肿瘤细胞来源的RNA致敏的DC能更有效地激活OVA特异性CTL的产生, 并且完全能够保护宿主不再受表达OVA的肿瘤细胞的攻击. 我们的结果与Boczkowski et al[23]的结果是一致的.

用胃癌细胞RNA致敏的DC接种对小鼠的免疫保护和免疫治疗, 这种方法从根本上讲至少可以部分地重建或强化胃癌局部的免疫功能, 对改善荷瘤宿主的生存状况有一定的帮助. DC网络是体内能提呈抗原给未致敏或静息T细胞的特异系统, 他在诱导T、B淋巴细胞免疫中起着关键性作用, 在肿瘤的免疫调控中有着相当重要的地位.

编辑: N/A

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