修回日期: 2003-07-10
接受日期: 2003-08-18
在线出版日期: 2004-01-15
目的: 以肠易激综合征(IBS)模型新概念建立一种便秘型IBS大鼠模型, 为IBS的研究提供新的条件.
方法: 出生后4 wk Wistar大鼠, 随机分为冰水灌胃组、常温水灌胃组及正常对照组. 前两组每日分别给予冰水及常温水灌胃14 d, 观察灌胃期间三组大鼠灌胃后3 h内和3-24 h间的大便粒数及含水量变化, 停止灌胃后继续观察 14 d对应时间段的大便粒数及含水量变化以评价其便秘. 28 d观察结束后给予直肠内球囊扩张, 测定引起腹部收缩反射的最小容量阈值及直肠内球囊不同容量扩张时腹部收缩反射的次数, 评价其肠道对扩张刺激的敏感性. 各组动物回盲部及结肠肥大细胞(MC)研究应用甲苯胺蓝染色、计数. 5-羟色胺(5-HT)在肠道的表达应用免疫组织化学染色及彩色病理图像分析系统进行半定量分析.
结果: 冰水灌胃组大鼠灌胃后3 h内大便粒数及含水量较常温水灌胃组和正常对照组明显增加(P <0.05); 停止灌胃后三组大鼠对应时间段3 h内大便粒数及含水量无明显差异(P >0.05). 冰水灌胃组前14 d灌胃后3-24 h间的大便粒数及含水量均较常温水灌胃组和正常对照组明显减少(P<0.05); 停止灌胃后, 此趋势继续保持至第28 d实验结束. 直肠内球囊扩张时, 冰水灌胃组引起腹部收缩的最小容量阈值略高于正常对照组, 但统计学比较无明显差异(P>0.05). 直肠球囊体积1.0 mL低容量扩张时冰水灌胃组3 min内腹部收缩反射次数明显低于正常对照组(P<0.05); 球囊体积1.5 mL, 2.0 mL高容量扩张时两组无明显差异(P>0.05). 冰水灌胃组回盲部和结肠MC计数均明显高于正常对照组(P<0.05). 冰水灌胃组回盲部、结肠黏膜层5－HT阳性细胞的面积均明显高于正常对照组(P<0.05).
结论: 采用冰水灌胃法建立了大鼠便秘模型, 该模型具有肠道敏感性降低、回盲部及结肠MC增多、5-HT阳性内分泌细胞增多, 较好地模拟了人的C-IBS特征, 显示了IBS动物模型的新概念.
引文著录: 彭丽华, 杨云生, 孙刚, 王巍峰. 便秘型肠易激综合征新概念模型的建立. 世界华人消化杂志 2004; 12(1): 112-116
Revised: July 10, 2003
Accepted: August 18, 2003
Published online: January 15, 2004
AIM: To set up a new model of constipation-predominant irritable bowel syndrome (C-IBS) in rats and to study the possible pathogenesis of IBS.
METHODS: Wistar rats of postnatal four weeks were divided into three groups: group A (stomach irritation with 0-4 ℃ cool water), group B (stomach irritation with room temperature water) and group C (control group). Both of rats in groups A and B received stomach irritation daily for fourteen d. In these fourteen d, the feces of rats in three groups were collected and the feces granules were counted, moisture contents of the feces were calculated daily during 0 to 3 h and 3 to 24 h, respectively. After suspending the irritation of cool water, the granules and moisture contents of feces in corresponding periods were observed for the following fourteen d continuously in order to evaluate the degree of constipation. Then perception thresholds and the number of abdominal withdrawal reflexes (AWR) were recorded during rectal balloon distention in order to evaluate bowel sensitivity. The ileocecal junction and colon samples were stained by haematoxylin-eosin (HE) for routine pathologic examination and the improved toluidine blue method for mast cells, respectively. The expression of 5-hydroxymetryptamine (5-HT) on bowel was showed by immunohistochemical staining, and analyzed semi-quantitatively by computer color image analyzer.
RESULTS: The granules and moisture contents of feces during 0 to 3 h after cool water irritation were significantly higher in group A than in groups B and C (P < 0.05), but the differences disappeared after suspending irritation(P > 0.05). The granules and moisture contents of feces during 3 to 24 h after cool water irritation were significantly lower in group A than in groups B and C (P < 0.05). After suspending stomach irritation with cool water, the tendency lasted at least for fourteen d. The perception threshold of group A was slightly higher than that of group C during rectal balloon distention, but there was no significant difference (P > 0.05). The number of AWR to the lower balloon content (1.0 mL) was much lower in group A than in group C (P < 0.05), but the AWR to the balloon distention at 1.5mL and 2.0mL were similar between these two groups. In group A, the number of mast cells (MCs) in the ileocecal junction and colon were significantly higher than those of group C (P < 0.05), and the areas of 5-HT positive cells were markedly higher than those of group C (P < 0.05).
CONCLUSION: The model of C-IBS induced by stomach irritation with cool water is stable for constipation and characterized by decreased bowel sensitivity, increased MCs and 5-HT immunoreactive positive cells, which satisfactorily imitates the bowel features of C-IBS patients and shows a new concept model for IBS.
- Citation: Peng LH, Yang YS, Sun G, Wang WF. A new model of constipation-predominant irritable bowel syndrome in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2004; 12(1): 112-116
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v12/i1/112.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v12.i1.112
肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是以腹痛或腹部不适伴大便异常为特征的一种功能性肠病[1-6], 尽管近年的一些研究发现IBS患者可能存在肠道肥大细胞(mast cell, MC)数目及活性的改变, 血中5-羟色胺(5-hydroxymetryptamine, 5-HT)、胃动素等胃肠激素、淋巴细胞以及肠道内分泌细胞等的变化, 但目前一般认为IBS尚缺乏确切的形态学和生化指标的异常[7-14]. 由于IBS被认为是一种功能性疾病, 要研究其功能异常的物质基础如肠道或神经系统的组织或细胞等均十分困难, 严重阻碍了对其发病机制的研究和认识. 因此, 建立恰当的IBS动物模型对于研究其发病机制具有十分重要的意义. 我们模拟人IBS危险因素-冷水饮用, 用冰水灌胃法诱导大鼠便秘, 并评价其肠道敏感性改变、肠道MC及5-HT阳性内分泌细胞的变化, 旨在建立一种较为理想的具备IBS模型新概念的C-IBS大鼠模型.
AY220型托盘电子分析天平, 日本导津制作所制作. Olympus CX40光学显微镜, 日本奥林巴斯公司制作. 8F导尿管, 导管直径2 mm, 球囊最大容量3 mL, 最大直径2 cm, 用作直肠内球囊扩张导管, 德国Braun公司制作. 直径6 cm鼠固定器, 日本ICM株式会社制作. 兔抗人5－HT多克隆抗体, 生物素标记羊抗兔IgG, SABC免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自北京中山生物技术有限公司. 出生4 wk的♂Wistar大鼠30只, 质量120-150 g, 军事医学科学院实验动物中心提供.
30只大鼠随机分为3组, A组10只, 为冰水灌胃组, 给予冰水(0-4 ℃生理盐水) 2 mL/只, 1次/d灌胃, 共14 d; B组10只, 为常温水灌胃组, 给予常温水(26-28 ℃生理盐水) 2 mL/只, 1次/d灌胃, 共14 d; C组10只, 为正常对照组, 不灌胃, 正常饲食、饮水. A、B两组除灌胃外也给予正常饲食、饮水. 每只大鼠分笼独立饲养, 为消除生物节律的影响, 均于上午08: 00开始灌胃. 停止灌胃后各组继续正常饲食、饮水, 观察14 d, 至第28 d实验结束. 分别收集灌胃14 d期间3组每只大鼠灌胃后3 h内及3-24 h间的大便, 计大便粒数, 电子天平称湿质量, 微波烘烤8 min后称干质量, 计算大便含水量百分比. 含水量百分比= (湿质量-干质量)/湿质量×100%. 停止灌胃后各组继续观察14 d, 同样方法测定对应时间段每只大鼠大便粒数及含水量百分比(以下简称含水量)至第28 d实验结束, 以评价其便秘.
1.2.1 肠道敏感性测定: 灌胃停止后14 d, 3组大鼠分别于清醒状态下放入鼠固定器内, 限制大鼠的各向活动, 但可观察到腹部收缩反射. 将Braun 8F导尿管外涂石蜡油后经肛门插入, 气囊末端距肛门1 cm. 用4号手术缝线在导尿管平肛门外缘水平打结固定于鼠尾, 相隔2 cm处同样方法固定. 15 min后大鼠适应环境呈安静状态, 经导尿管外口向球囊内注入常温水(26-28℃生理盐水) 扩张. 记录引起大鼠腹部收缩反射的最小注水量为最小容量阈值. 重复扩张3次, 每次间隔15 min, 以3次扩张测得的最小容量阈值的均值为该鼠直肠扩张引起腹部收缩反射的最小容量阈值. 测定阈值后第2 d, 分别测定注水量为1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL时3 min内大鼠腹部收缩反射的次数, 每次间隔30 min. 用引起大鼠腹部收缩反射的最小容量阈值和直肠内球囊不同容量扩张时3 min内大鼠腹部收缩反射的次数评价大鼠对直肠内扩张刺激的敏感性.
1.2.2 组织形态学检查及MC计数: 3组大鼠直肠内球囊扩张结束1 h后, 给予大鼠腹腔内注射200 g/L乌拉坦2 mL/只处死动物, 剖腹分离各组大鼠的回盲部及结肠, 立即用生理盐水冲洗, 分别取动物的回盲部、距肛门3 cm处的结肠各0.5 cm, 40 g/L甲醛固定, 常规石蜡包埋切片, 苏木素-伊红 (haematoxylin-eosin, HE)染色, Olympus CX40光学显微镜下观察各组大鼠胃、回盲部及结肠组织学表现. 石蜡标本连续切片, 片厚2 m, 隔5张取1张, 每例每部位取2张, 采用甲苯胺蓝改良染色法(toluidine blue improved method, TBI)行MC染色. 每例切片随机选择2个视野, 应用放大倍数×100观察各组动物回盲部及结肠MC数目, 取其均数.
1.2.3 5-HT在肠道的表达 取3组大鼠回盲部及结肠石蜡标本连续切片, 片厚2 m, 隔5张取1张. 每例每部位取2张. 裱于经APES防脱片剂处理的载玻片上, 置烤箱56 ℃ 60 min以使切片紧密黏附. 应用1: 100稀释的兔抗5-HT抗体, 按ABC免疫组化法进行标记, 操作步骤按试剂说明. DAB室温显色5-10 min, 镜下控制反应时间. 以着棕色者为染色阳性. 应用计算机病理图像分析系统对5-HT免疫染色阳性细胞的面积(阳性染色部位像素数总和)进行半定量分析.
统计学处理 计数资料用mean±SD描述, 组间变量比较用单因素方差分析及带有一个重复测量的单因素方差分析, 设P<0.05为差异显著.
大鼠灌胃后3 h内大便增加, 大便明显变软, 变稀, 部分大鼠可出现糊状便. 经含有重复测量的单因素方差分析, 结果显示, 前14 d灌胃期间, 冰水灌胃组大鼠灌胃后3 h内大便粒数和含水量均明显多于常温水灌胃组和正常对照组(P<0.05). 15-28 d停止灌胃期间, 冰水灌胃组大鼠对应时间段3 h内大便粒数和含水量无显著差异(P>0.05). 前14 d灌胃期间, 冰水灌胃组灌胃后3-24 h间的大便粒数由49.4±7.5粒降至39.9±6.2粒, (常温水灌胃组由48.9±6.5粒降至41.4±7.6粒, 正常对照组由49.5±7.2粒升至50.8±8.7粒). 第28 d实验结束时3组大鼠对应时间段3-24 h间的大便粒数分别为冰水灌胃组42.9±6.7粒, 常温水灌胃组43.9±7.9粒和正常对照组49.5±5.8粒. 经含有重复测量的单因素方差分析, 冰水灌胃组前14 d灌胃后3-24 h间的大便粒数及15-28 d停止灌胃后对应时间段3-24 h间的大便粒数均较常温水灌胃组和正常对照组明显减少(P<0.05); 以28 d期间作为总体进行比较, 3组大鼠3-24 h间的大便粒数存在显著差异, 冰水灌胃组3-24 h间的大便粒数明显少于常温水灌胃组和正常对照组(P<0.05), 见图1. 大鼠灌胃后3-24 h间的大便逐渐由灌胃后3 h内的糊状便、软便转为较干燥的成形便; 随实验天数的增加, 伴随大便粒数逐渐减少的同时出现大便性状逐渐干硬. 前14 d灌胃期间, 冰水灌胃组大鼠灌胃后3-24 h间的大便含水量由45.2%±5.8%降至40.3%±6.5%(常温水灌胃组由43.0%±6.5%升至44.7%±6.4%, 正常对照组由46.2%±8.0%降至42.5%±9.4%) 第28 d实验结束时3组大鼠对应时间段3-24 h间的大便含水量分别为冰水灌胃组39.9%±6.5%, 常温水灌胃组46.6%±4.4%和正常对照组47.1%±8.6%. 经含有重复测量的单因素方差分析, 冰水灌胃组大鼠灌胃后3-24 h间的大便含水量及停止灌胃后对应时间段3-24 h间的大便含水量均较常温水灌胃组和正常对照组明显减少(P<0.05); 以28 d期间作为总体进行比较, 3组大鼠3-24 h间的大便含水量存在显著差异, 冰水灌胃组3-24 h间的大便含水量明显少于常温水灌胃组和正常对照组(P<0.05), 图2.
冰水灌胃组直肠扩张引起腹部收缩的最小容量阈值为0.59±0.09 mL, 常温水灌胃组为0.54±0.07 mL, 正常对照组为0.57±0.13 mL. 冰水灌胃组略高于正常对照组和常温水灌胃组, 但统计学比较3组无明显差异(P>0.05). 3组大鼠直肠内球囊 1.0 mL低容量扩张时, 3 min内腹部收缩反射次数存在显著差异(P<0.05); 冰水灌胃组3 min内腹部收缩反射次数为10.3±3.3次, 明显低于正常对照组的18.3±5.5次(P<0.05), 表1; 常温水灌胃组与正常对照组无明显差异(P>0.05). 直肠球囊体积1.5 mL、2.0 mL高容量扩张时, 3组大鼠3 min内腹部收缩反射次数无明显差异(P>0.05).
3组大鼠胃、回盲部及结肠均未见异常病理改变. 冰水灌胃组回盲部及结肠MC计数分别为12.6±4.8/视野和10.2±3.0/视野, 较常温水灌胃组(9.2±3.2/视野, 7.4±2.8/视野)及正常对照组(7.9±3.4/视野, 5.0±2.1/视野)均明显增多(P<0.05).
5-HT阳性细胞在正常大鼠回盲部及结肠黏膜层分布广泛, 黏膜上皮细胞、固有层腺体均可见阳性反应, 着色部位均在胞质(图3). 冰水灌胃组大鼠5-HT的表达部位与正常大鼠一致, 但5-HT阳性细胞面积(即细胞数目)明显增多(图4). 3组大鼠回盲部及结肠黏膜层5-HT阳性细胞面积的比较见表2. 3组大鼠回盲部及结肠黏膜层5-HT阳性细胞面积均存在显著差异(P<0.05); 冰水灌胃组回盲部、结肠黏膜层5-HT阳性细胞面积显著高于常温水灌胃组及正常对照组(P<0.05).
IBS的发病机制目前认为有运动异常机制、内脏过敏机制、脑-肠相互作用机制, 以及近年来提出的神经-免疫-内分泌网络调控机制等. 由于IBS被认为是一种功能性肠病, 要研究其肠道或神经系统的生理生化或细胞的异常等均十分困难, 因此IBS发病机制的研究一直未取得显著的进展. 我们应用人类IBS比较公认的一种危险因素-冷饮刺激, 用冰水灌胃法诱导大鼠IBS模型. 实验发现, 经过14 d的冰水灌胃刺激能够诱发大鼠的大便粒数和含水量减少, 类似于便秘型IBS的肠道运动异常, 并且此趋势在停止灌胃刺激后仍能持续存在, 保持稳定. 实验中我们发现常温水灌胃组也能出现一定程度的肠道运动异常, 可能是反复抓取及灌胃动作的刺激诱发的应激反应, 这也从一个侧面说明IBS的诱因是多方面的, 精神心理因素也在其中起一定作用. 但冰水灌胃组与常温水灌胃组的比较显示, 冰水灌胃建立的模型比常温水灌胃更显著、稳定, 表现为肠道运动异常持续的时间更长, 与正常对照组的差异更明显, 提示冷饮危险因素中温度是引起肠道运动异常的关键因子. 实验中我们还发现, 灌胃后3 h内的大便粒数及含水量增加, 而灌胃后3-24 h间的大便粒数及含水量减少; 停止灌胃后, 对应的3 h内大便粒数及含水量的差异消失, 而对应的3-24 h间的大便粒数及含水量减少趋势依然存在. 这一现象产生的原因可能是灌胃后3 h内的大便粒数及含水量反映的是大鼠对急性刺激的一种反应, 在停止急性刺激后, 这种反应消失; 而灌胃后3-24 h的大便粒数及含水量反映的才是冰水灌胃这一因素反复、慢性刺激对肠道运动产生的影响, 这种影响具有稳定的后续效应. 国外有文献报告急性、慢性刺激对大鼠直肠敏感性的影响也是不同的, 提示急性、慢性刺激对肠道运动和感觉的作用机制可能存在差异[15]. 桂先勇et al[16]发现持续6 h的寒冷束缚应激期间及应激后大便粒数明显减少, 而含水量却明显增加, 且这一现象在解除应激后60 h仍未恢复, 提示持续一定时间和一定强度的应激可导致结肠动力持续异常, 且具有后续效应. 我们的实验较上述实验延长了刺激时间和停止刺激后的观察时间, 观察了冰水灌胃14 d期间及停止灌胃后14 d期间大鼠的大便粒数及含水量变化, 较以往的研究更确切地反映出动物在反复接受冷刺激时对肠道运动的持续影响和远期效应. 这种效应表现为类似于C-IBS的肠道运动异常, 而非单次冷刺激引起的类似D-IBS的肠道运动异常. 以往的IBS动物模型如束缚应激模型、旋毛虫感染模型[17]等多为D-IBS的模型, 对于C-IBS的动物模型少见报道. 我们用冰水灌胃法成功地诱导了大鼠大便粒数和含水量的减少, 并且这种趋势能稳定存在至少14 d, 这种现象类似于C-IBS的肠道运动异常. 该模型为C-IBS的研究提供了新的条件.
在肠道敏感性或内脏敏感性的研究中, 人们多采用直肠内球囊定量扩张的方法评价其敏感性变化. 对于C-IBS患者的内脏敏感性报道不一, 有报告认为C-IBS患者的初始感觉阈值、疼痛阈值、排便阈值高于正常人, 即C-IBS患者内脏敏感性降低, 但也有学者认为C-IBS患者存在内脏高敏感[18-26]. 我们发现冰水灌胃后的大鼠引起腹部收缩反射的最小容量阈值有增高趋势, 在低容量(1.0 mL)扩张时冰水灌胃组腹部收缩反射次数明显少于正常对照组, 提示冰水灌胃组大鼠存在对直肠内球囊扩张刺激的敏感性降低; 而在高容量时其内脏敏感性与正常对照组无明显差异, 是否因为冰水灌胃组大鼠存在内脏感觉异常, 但直肠平滑肌对于球囊扩张刺激的牵张反应是不同的. IBS患者对于直肠球囊扩张刺激以外的不同种刺激的敏感性是否也存在差异尚不清楚.
近年来, 一些研究发现IBS患者肠道MC增多. 1993年Weston et al[27]首先报道IBS患者回肠末端MC明显增多, 推测MC与IBS的内脏感觉异常有关. 国内杨云生et al[28]、李兆申et al[29]也相继报道IBS患者回盲部MC增多, MC与无髓神经纤维密切相邻, 并进一步发现肠道浆细胞数目增多. 另外, Monica et al[30]还报道IBS患者乙状结肠黏膜中5-HT阳性细胞明显增多. 人体90%的5-HT来源于胃肠道, 主要由胃肠道腺腔基底部的神经内分泌细胞合成、分泌并重摄取. 研究证实, 各种刺激如肠腔内压力增加、迷走神经刺激、过敏反应、十二指肠酸化、暴露于去甲肾上腺素、乙酰胆碱和多种化学物质, 均可促使神经内分泌细胞释放5-HT, 与其受体结合, 传递信号给肠肌间神经丛, 调节肠道的蠕动反射. 因此, 本研究用5-HT阳性细胞数目代表肠道内分泌细胞的数目. 结合最新的研究进展, 国际上一些学者提出理想的IBS动物模型的新概念应反映肠道运动、敏感性改变, 肠道MC变化, 甚至肠道内分泌细胞的变化. 本研究建立的大鼠C-IBS模型不仅表现有肠道运动、敏感性改变, 而且存在回盲部、结肠MC及5-HT阳性细胞明显增多, 反映了IBS动物模型的新概念. 该模型的建立为今后深入研究IBS的发病机制等提供了新的基础或条件.
编辑: N/A
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