肝癌 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-09-15; 11(9): 1341-1344
在线出版日期: 2003-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i9.1341
KAI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响
司遂海, 杨建民, 罗元辉, 房殿春, 周平
司遂海, 杨建民, 罗元辉, 房殿春, 周平, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化内科中心 重庆市 400038
司遂海, 男, 1966-10-26生, 河南新郑人, 汉族, 1989年第三军医大学本科毕业, 2000年第三军医大学消化系病学硕士研究生.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30070348
通讯作者: 杨建民, 400038, 重庆市, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化内科中心. jianminyang@hotmail.com
电话: 023-68754678 传真: 023-68754124
收稿日期: 2002-07-31
修回日期: 2002-10-20
接受日期: 2002-08-16
在线出版日期: 2003-09-15

目的

构建KAI1基因正、反义真核表达质粒, 了解其对高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.

方法

利用亚克隆技术构建KAI1基因正、反义真核表达质粒, 并用脂质体法将其分别转入高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞系, 通过免疫细胞化学SP法检测KAI1蛋白表达情况.

结果

限制性内切酶分析证明两个重组子的结构均与KAI1正、反义基因表达质粒的预期结构一致. 免疫细胞化学SP法检测显示, 转入正义KAI1基因后的肝癌细胞KAI1蛋白染色加深, (细胞积分光密度integra oculus dehter, IOD 20.127±5.099 vs 12.675±1.921, P <0.01); 而转入反义KAI1基因的肝癌细胞则KAI1蛋白染色变浅, (IOD 8.681±2.472 vs 12.675±1.921, P <0.01).

结论

成功构建了KAI1基因正、反义真核表达质粒. KAI1正义基因能上调肝癌细胞KAI1蛋白的表达, 相反, KAI1反义基因则能下调肝癌细胞KAI1蛋白的表达.

关键词: N/A
引文著录: 司遂海, 杨建民, 罗元辉, 房殿春, 周平. KAI1正反义基因对MHCC97-H肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(9): 1341-1344
Effects of KAI1 gene on KAI1 protein expression in MHCC97-H hepatocellular carcinoma cells with high metastatic potential
Sui-Hai Si, Jian-Min Yang, Yuan-Hui Luo, Dian-Chun Fang, Ping Zhou
Sui-Hai Si, Jian-Min Yang, Yuan-Hui Luo, Dian-Chun Fang, Ping Zhou, Gastroenterology Research Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Supported by the National Natural Science Foundation of China, No. 30070348
Correspondence to: Jian-Min Yang, Gastroenterology Research Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China. jianminyang@hotmail.com
Received: July 31, 2002
Revised: October 20, 2002
Accepted: August 16, 2002
Published online: September 15, 2003

AIM

To construct sense and antisense KAI1 expression plasmids and to explore their effects on KAI1 protein expression in MHCC97-H hepatocellular carcinoma cells with high metastatic potential.

METHODS

Sense and antisense KAI1 expression plasmids were constructed using subclone technique and transfected into MHCC97-H cells by DOTAP liposome system. KAI1 protein expression in transfected MHCC97-H cells was analyzed with immunocytochemical SP method.

RESULTS

Analysis of restriction endonuclease indicated the structure of two recombinants was consistent with the expected results of sense and antisense KAI1 expression plasmids. Compared with MHCC97-H cells, KAI1 protein staining in the MHCC97-H-S cells transfected with sense KAI1 expression plasmid was obviously enhanced(Integra Oculus Dehter ,IOD 20.127±5.099 vs 12.675±1.921,P <0.05).However, KAI1 expression in the MHCC97-H-AS cells transfected with KAI1 antisense gene was obviously weakened (IOD 8.681±2.472 vs 12.675±1.921, P <0.05).

CONCLUSION

We successfully constructed sense and antisense KAI1 expression plasmids. Sense KAI1 gene can upregulate the expression of KAI1 protein in MHCC97-H cells. On the other hand, antisense KAI1 gene can downregulate the expression of KAI1 protein in MHCC97-H cells.

Key Words: N/A
0 引言

肝癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一[1-7], 在诊断时多已发生肝内或远处转移, 部分患者虽可进行手术切除, 但术后复发率高[8-16]. 因此, 转移与复发是影响肝癌预后的最主要因素[17]. KAI1基因是近年来发现的一种新的肿瘤转移抑制基因, 国外已在前列腺癌等肿瘤的研究中得到证实[18], 但KAI1基因在肝癌转移中的作用尚不清楚. 我们利用亚克隆技术构建了正、反义KAI1基因真核表达质粒, 并将其分别转染入具有高转移潜能的肝癌细胞系MHCC97-H, 以免疫细胞化学SP法观察其对肝癌细胞KAI1蛋白表达的影响.

1 材料和方法
1.1 材料

pCMV-KAI1表达质粒由美国国立卫生研究院(NIH) Barrett教授和Dong博士惠赠, 其中1.6 kb的KAI1 cDNA经Xhol I位点插入pCMV-neo, 构成重组质粒pCMV-KAI1; 真核表达质粒载体pCI-neo为Promega公司产品, 大肠杆菌株DH5α由本室周平博士惠赠; 各种限制性内切酶、小牛肠碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶均为New England Biolabs公司产品; 凝胶提取试剂盒、快速质粒提取盒为Promega公司产品; 转染用脂质体DOTAP为Roche公司产品; 筛选用G418抗生素为Pierce公司产品. 培养细胞用高糖DMEM培养基和胎牛血清为Hyclone公司产品; 免疫细胞化学SP试剂盒及DAB染色试剂盒为北京中山生物技术有限公司产品. KAI1兔抗人单克隆抗体为Santa Cruz公司产品; MHCC97-H是一种高转移潜能的肝细胞癌细胞系[19], 购自上海复旦大学医学院中山医院肝癌研究所.转染前后均以高糖DMEM培养基(加100 ml/L胎牛血清、青霉素100 kU/L、链霉素100 kU/L)在37 °C, 50 ml/L CO2, 饱和湿度条件下培养.

1.2 方法

KAI1基因正、反义真核表达质粒的亚克隆重组及鉴定. 经分析物理图谱以Xba I将pCMV-KAI1表达质粒(全长8.2 kb)及真核表达载体质粒pCI-neo(全长5.47 kb)酶切, 电泳证实酶切完全后, 用凝胶提取试剂盒提取来自pCMV-KAI1表达质粒、含KAI1 cDNA的3 kb目的片段和线性化的pCI-neo. 为防止线性化载体的粘性未端发生自身环化或串联, 以小牛肠碱性磷酸酶(CIP)将线性化的真核表达载体质粒pCI-neo 5'端去磷酸化, 然后用T4 DNA连接酶将目的片段与线性化质粒载体连接. 连接产物转化DH5α制备的感受态细菌, 铺板经氨苄青霉素筛选菌落, 扩增后以快速质粒提取盒提取质粒, 进而酶切鉴定.基因转染及细胞的筛选. MHCC97-H细胞在6孔培养板中, 用含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM, 在37 °C, 50 mL/L CO2条件下培养至细胞60-80 %汇合. 采用DOTAP脂质体介导基因转染的方法(按产品说明书操作). 准备溶液A: 于100 mL无血清DMEM细胞培养液中加6 mg 质粒. 准备溶液B: 于85 mL无血清高糖DMEM细胞培养液中加15 mL脂质体, 轻轻混匀A, B液, 室温放置15 min, 补足1 mL无血清高糖DMEM, 加在用无血清高糖DMEM培养液洗过两次的细胞单层上, 37 °C, 50 mL/L CO2培养8 h. 换用含100 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养基, 37 °C, 50 mL/L CO2培养48 h, 按1:4传代, 加含1 000 mg/L G418的培养基进行筛选, 直到筛选出阳性克隆. 混合所有阳性克隆, 再扩增培养, G418以250-300 mg/L维持.设立空载体pCI-neo转染作为对照. 免疫细胞化学分析. 采用免疫细胞化学SP法, 操作过程依说明书进行. 阴性对照以PBS代替一抗, 苏木素染色前以TIGER-920图像仪(V3.3)进行图像分析.

统计学处理 采用SPSS(V10.0)统计程序包进行分析, P <0.05为差异显著, P <0.01为差异非常显著, P >0.05为差异不显著.

2 结果
2.1 KAI1正反义真核表达重组质粒构建及鉴定

因pCMV-KAI1质粒与真核表达载体质粒pCI-neo均系采用Xba I酶切, 因此, 重组后目的片段就有正、反两个方向插入的可能.为证实并区分重组的正、反义真核表达质粒, 选取目的片段中一个偏离中心位置的Sal I酶切位点及pCI-neo本身的一个Sal I位点, 用Sal I酶切重组子, 分别得到预测的正义重组质粒的2.25 kb, 6.22 kb两个片段及反义重组质粒的0.75 kb, 7.72 kb两个片段(图1A).为进一步证实目的片段已插入载体, 再用Xba I酶切所获得的两个重组子, 均又重新获得3 kb及5.4 kb片段(图1B), 证明已获得KAI1正、反义真核表达质粒两个重组子, 分别命名为pCI-KAI1及pCI-anti-KAI1. KAI1基因正反义真核表达质粒构建流程如图2所示.

图1
图1 正反义重组质粒的Sal I和Xba I酶切图. M: lDNA/HindIII Marker (23.13 kb, 9.42 kb, 6.56 kb, 4.36 kb, 2.32 kb, 2.02 kb) 1, 2: pCI-KAI 3, 4: pCI-anti-KAI1.
图2
图2 KAI1基因正反义真核表达质粒的构建流程图.
2.2 免疫细胞化学分析

转染pCI-KAI1的肝癌细胞命名为MHCC97-H-S, 转染pCI-anti-KAI1的肝癌细胞命名为MHCC97-H-AS. 免疫细胞化学SP法检测显示MHCC97-H-S细胞KAI1蛋白染色较MHCC97-H细胞深, IOD为 20.127±5.099, MHCC97-H细胞为12.675±1.921(均为苏木素染色前测定), 二者有明显区别(P <0.05); 而MHCC97-H-AS细胞KAI1蛋白染色较MHCC97-H细胞浅, IOD为8.681±2.472 , 与MHCC97-H细胞有明显区别(P <0.05). 苏木素染色后的图像见(图3 A-C).转染空载体pCI-neo后细胞KAI1蛋白染色情况与MHCC97-H细胞则无明显差别.

图3
图3 免疫组化SP染色结果(SP×400). A MHCC97-H-S细胞; B MHCC97-H细胞; C MHCC97-H-AS细胞.
3 讨论

流行病学的研究资料表明, 近年来我国肝细胞癌的发病率有明显增加趋势. 但有关肝细胞癌的发病机制, 目前仍不完全清楚. 分子生物学方面的研究显示癌基因异常表达与抑癌基因异常失活是癌细胞无限增生的重要原因[20-24]. 肿瘤不仅在原发灶通过肿瘤血管从宿主获得营养, 而且向宿主输出大量恶性细胞, 导致肿瘤不断生长和转移[25-28]. 因此, 肿瘤的转移和复发机制及其防治研究已成为当今肿瘤研究的重点方向之一.

KAI1基因是Dong et al [18]于1995年首先在前列腺癌细胞中克隆出的一种肿瘤转移抑制基因.该基因位于人类染色体11p11.2, 编码产物为含267个氨基酸的细胞膜糖蛋白, Mr 29 600道尔顿.进一步的研究显示, KAI1不仅在前列腺癌细胞表达下调, 而且在食管癌[29] 、胃癌[30] 、肝癌[31]、胰腺癌[32,33]、结直肠癌[34]等多种消化系统转移性肿瘤中表达下调. 其分子结构中有4个疏水区和1个含有3个潜在N-糖基化位点的细胞外亲水区, 因而属跨膜4超家族(transmembrane 4 superfamily, TM4SF)成员. 因他们均系细胞膜糖蛋白, 作用于细胞-细胞或细胞-细胞间基质之间, 故推测其可能介导细胞间及细胞与间质之间的黏附, 因而其表达的下调可能参与肿瘤细胞的转移.目前, 有关KAI1基因与肝细胞癌关系的研究文献报道很少. Sun et al用RT-PCR法研究了42例肝癌标本, 发现57.1 %的肿瘤组织中KAI1表达呈阳性. 其表达率与肝癌大小、有无包膜及AFP是否阳性无关, 但有肝内转移者比无肝内转移者表达率明显下降 [31]. Guo et al 用Northern blot及原位杂交技术研究也有类似的发现[34]. 这些研究结果提示KAI1基因可能在肝癌细胞侵袭及转移中起着重要作用.

虽然有关KAI1基因与人类肿瘤转移抑制关系的研究已有不少报道, 但大多是从临床病理学的角度进行, 目前KAI1基因在肝癌转移中作用及其机制仍不清楚. 在本实验中, 通过亚克隆重组技术, 并经酶切证实, 成功构建了KAI1基因的正、反义真核表达质粒, 并应用脂质体DOTAP转染技术将其分别转入具有高转移潜能的肝癌细胞系MHCC97-H中. 结果显示转入正义KAI基因后肝癌细胞中KAI1蛋白表达上调, 相反, 转入KAI1反义基因后则KAI1蛋白表达下调. 说明KAI1正、反义基因转染可影响肝癌细胞KAI1蛋白的表达. 这种基因转染对高转移潜能MHCC91-H肝癌细胞系的生长、侵袭、转移的影响及其机制的研究, 我们正在进行之中.

1.  Lee JH, Ku JL, Park YJ, Lee KU, Kim WH, Park JG. Establishment and characterization of four human hepatocellular carcinoma cell lines containing hepatitis B virus DNA. World J Gastroenterol. 1999;5:289-295.  [PubMed]  [DOI]
2.  Zhang J, Liu YF, Yang SJ, Sun ZW, Qiao Q, Zhang SZ. Construction and expression of mouse/humanized scFv and their fusion to humanized mutant TNF a against hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2000;8:616-620.  [PubMed]  [DOI]
3.  Wang JP, Duan GR, Zhao YL, Du DW. Effect of p16 gene expression in growth of human hepatic carcinoma cell line 7721 with confocal microscopic analysis. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2000;8:767-770.  [PubMed]  [DOI]
4.  Shao XD, Wu KC, Guo XZ, Xu JH, Guo CC, Meng FP, Fan DM. Studies on expression of KAI1 gene in tissue of liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2001;9:1238-1241.  [PubMed]  [DOI]
5.  Liang Y, Lu B, Cui ZF, Li XD, Guo YJ, Liu YJ. The expression of Fas/FasL in hepatocellular carcinomas. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2001;9:1364-1368.  [PubMed]  [DOI]
6.  Cheng H, Liu YF, Zhang HZ, Shen WA, Zhang SZ. Construction and expression of anti-HCC immunotoxin of sFv-TNF-a and GFP fusion proteins. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2001;9:640-644.  [PubMed]  [DOI]
7.  Jiang YG, Wang YM, Li QF. Expression significance of HLA-DR antigen and heat shock protein 70 in hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2001;9:1139-1142.  [PubMed]  [DOI]
8.  Tang ZY, Sun FX, Tian J, Ye SL, Liu YK, Liu KD, Xue Q, Chen J, Xia JL, Qin LX. Metastatic human hepatocellular carcinoma models in nude mice and cell line with metastatic potential. World J Gastroenterol. 2001;7:597-601.  [PubMed]  [DOI]
9.  Ikeda M, Okada S, Ueno H, Okusaka T, Kuriyama H. Spontaneous regression of hepatocellular carcinoma with multiple lung metastases: a case report. Jpn J Clin Oncol. 2001;31:454-458.  [PubMed]  [DOI]
10.  Wang ZX, Hu GF, Wang HY, Wu MC. Expression of liver cancer associated gene HCCA3. World J Gastroenterol. 2001;7:821-825.  [PubMed]  [DOI]
11.  Tang ZY. Hepatocellular carcinoma-Cause, treatment and metastasis. World J Gastroenterol. 2001;7:445-454.  [PubMed]  [DOI]
12.  Cui J, Zhou XD, Liu YK, Tang ZY, Zile MH. Abnormal b-catenin gene expression with invasiveness of primary hepatocellular carcinoma in China. World J Gastroenterol. 2001;7:542-546.  [PubMed]  [DOI]
13.  Huang XF, Wang CM, Dai XW, Li ZJ, Pan BR, Yu LB, Qian B, Fang L. Expressions of chromogranin A and cathepsin D in human primary hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 2000;6:693-698.  [PubMed]  [DOI]
14.  Parks RW, Garden OJ. Liver resection for cancer. World J Gastroenterol. 2001;7:766-771.  [PubMed]  [DOI]
15.  Xu HY, Yang YL, Guan XL, Song G, Jiang AM, Shi LJ. Expression of regulating apoptosis gene and apoptosis index in primary liver cancer. World J Gastroenterol. 2000;6:721-724.  [PubMed]  [DOI]
16.  Lin NF, Tang J, Mohamed Ismael HS. Study on environmental etiology of high incidence areas of liver cancer in China. World J Gastroenterol. 2000;6:572-576.  [PubMed]  [DOI]
17.  陈 孝平, 吴 在德, 裘 法祖. 加强基础研究, 提高原发性肝癌的外科治疗效果. 中华实验外科杂志. 2000;5:393-394.  [PubMed]  [DOI]
18.  Dong JT, Lamb PW, Rinker-Schaeffer CW, Vukanovic J, Ichikawa T, Isaacs JT, Barrett JC. KAI1, a metastasis suppressor gene for prostate cancer on human chromosome 11p11.2. Science. 1995;268:884-886.  [PubMed]  [DOI]
19.  Li Y, Tang ZY, Ye SL, Liu YK, Chen J, Xue Q, Gao DM, Bao WH. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World J Gastroenterol. 2001;7:630-636.  [PubMed]  [DOI]
20.  Yang JM, Wang RQ, Bu BG, Zhou ZC, Fang DC, Luo YH. Effect of hepatitis C virus infection on expression of several cancer-associated gene products in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 1999;5:25-27.  [PubMed]  [DOI]
21.  Qin LL, Su JJ, Li Y, Yang C, Ban KC, Yian RQ. Expression of IGF-II, p53, P21 and HBxAg in precancerous events of hepatocarcinogenesis induced by AFB1 and/or HBV in tree shrews. World J Gastroenterol. 2000;6:138-139.  [PubMed]  [DOI]
22.  Lin GY, Chen ZL, Lu CM, Li Y, Ping XJ, Huang R. Immunohistochemical study on p53, H-rasp21, c-erbB-2 protein and PCNA expression in HCC tissues of Han and minority ethnic patients. World J Gastroenterol. 2000;6:234-238.  [PubMed]  [DOI]
23.  Sun BH, Zhang J, Wang BJ, Zhao XP, Wang YK, Yu ZQ, Yang DL, Hao LJ. Analysis of in vivo patterns of caspase 3 gene expression in primary hepatocellular carcinoma and its relationship to P21WAF1 expression and hepatic poptosis. World J Gastroenterol. 2000;6:356-360.  [PubMed]  [DOI]
24.  Roberts LR, LaRusso NF. Potential roles of tumor suppressor genes and microsatellite instability in hepatocellular carcinogenesis in southern African blacks. World J Gastroenterol. 2000;6:37-41.  [PubMed]  [DOI]
25.  Guo XZ, Friess H, Shao XD, Liu MP, Xia YT, Xu JH, Buchler MW. KAI1 gene is differently expressed in papillary and pancreatic cancer: influence on metastasis. World J Gastroenterol. 2000;6:866-871.  [PubMed]  [DOI]
26.  Jiang BJ, Sun RX, Lin H, Gao YF. Study on the risk factors of lymphatic metastasis and the indications of less invasive operations in early gastric cancer. World J Gastroenterol. 2000;6:553-556.  [PubMed]  [DOI]
27.  Furger KA, Menon RK, Tuckl AB, Bramwelll VH, Chambers AF. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. Curr Mol Med. 2001;1:621-632.  [PubMed]  [DOI]
28.  Jaffe AB, Hall A. Rho GTPases in transformation and metastasis. Adv Cancer Res. 2002;84:57-80.  [PubMed]  [DOI]
29.  Uchida S, Shimada Y, Watanabe G, Li ZG, Hong T, Miyake M, Imamura M. Motility-related protein (MRP-1/CD9) and KAI1/CD82 expression inversely correlate with lymph node metastasis in oesophageal squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 1999;79:1168-1173.  [PubMed]  [DOI]
30.  Hinoda Y, Adachi Y, Takaoka A, Mitsuuchi H, Satoh Y, Itoh F, Kondoh Y, Imai K. Decreased expression of the metastasissuppressor gene KAI1 in gastric cancer. Cancer Lett. 1998;129:229-234.  [PubMed]  [DOI]
31.  Sun HC, Tang ZY, Zhou G, Li XM. KAI1 gene expression in hepatocellular carcinoma and its relationship with intrahepatic metastases. J Exp Clin Cancer Res. 1998;17:307-311.  [PubMed]  [DOI]
32.  Friess H, Guo XZ, Tempia-Caliera AA, Fukuda A, Martignoni ME, Zimmermann A, Korc M, Buchler MW. Differential expression of metastasis-associated genes in papilla of vater and pancreatic cancer correlates with disease stage. J Clin Oncol. 2001;19:2422-2432.  [PubMed]  [DOI]
33.  Lombardi DP, Geradts J, Foley JF, Chiao C, Lamb PW, Barrett JC. Loss of KAI1 expression in the progression of colorectal cancer. Cancer Res. 1999;59:5724-5731.  [PubMed]  [DOI]
34.  Guo XZ, Friess H, Di Mola FF, Heinicke JM, Abou-Shady M, Graber HU, Baer HU, Zimmermann A, Korc M, Buchler MW. KAI1, a new metastasis suppressor gene, is reduced in metastatic hepatocellular carcinoma. Hepatology. 1998;28:1481-1488.  [PubMed]  [DOI]