肝癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-09-15; 11(9): 1329-1332
在线出版日期: 2003-09-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i9.1329
GnRH类似物诱导肝癌细胞凋亡的体外研究
刘庆元, 窦科峰, 张金山, 孙岚, 黄鲁豫, 张远强
刘庆元, 窦科峰, 中国人民解放军第四军医大学西京医院肝胆外科 陕西省西安市 710033
刘庆元, 男, 1966-08-15生, 青海省西宁市人, 汉族, 主治医师.
张金山, 孙岚, 张远强, 中国人民解放军第四军医大学基础部组织学与胚胎学教研室 陕西省西安市 710033
黄鲁豫, 中国人民解放军第四军医大学西京医院全军创伤骨科研究所 陕西省西安市 710033
基金项目: 国家自然科学基金资助课题, No. 39900142
通讯作者: 张金山, 710033, 陕西省西安市长乐西路169号, 中国人民解放军第四军医大学基础部组织学与胚胎学教研室. jszhang@fmmu.edu.cn
电话: 029-3374511 传真: 029-3374512
收稿日期: 2003-04-15
修回日期: 2003-05-10
接受日期: 2003-06-02
在线出版日期: 2003-09-15

目的

研究GnRH类似物阿拉瑞林诱导体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721发生凋亡的作用, 为GnRH类似物用于肝癌的内分泌治疗提供实验资料.

方法

采用MTT法、形态学透射电镜观察和末端脱氧核苷酸标记法观察被阿拉瑞林处理后的SMMC-7721细胞的形态学和生化等指标的变化.

结果

MTT法研究结果表明阿拉瑞林在10-9 mol/L浓度时即可诱导7721细胞凋亡, 并呈量-效效应. 透射电镜下可观察到早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞以及核染色质浓缩并见凋亡小体. 末端脱氧核苷酸转移标记法进一步证实阿拉瑞林可以诱导肝癌细胞凋亡并可见凋亡小体; 与对照组相比, 阿拉瑞林处理后TUNEL凋亡指数显著增加(0.29±0.06 vs 0.11±0.03, P <0.05).

结论

GnRH类似物可诱导体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721发生凋亡, 从而提示GnRH类似物对人肝细胞性肝癌具有潜在的治疗作用.

关键词: N/A
引文著录: 刘庆元, 窦科峰, 张金山, 孙岚, 黄鲁豫, 张远强. GnRH类似物诱导肝癌细胞凋亡的体外研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(9): 1329-1332
Gonadotropin hormone-releasing hormone analog induces apoptosis in human hepatocarcinoma cell in vitro
Qing-Yuan Liu, Ke-Feng Dou, Jin-Shan Zhang, Lan Sun, Lu-Yu Huang, Yuan-Qiang Zhang
Qing-Yuan Liu, Ke-Feng Dou, Department of Hepato-Biliary Surgery of Xijing hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
Jin-Shan Zhang, Lan Sun, Yuan-Qiang Zhang, Teaching and Research Section of Histology and Embryology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
Lu-Yu Huang, Institute of Orthopaedics of Chinese PLA, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by the National Natural Science Foundation of China, No. 39900142
Correspondence to: Jin-Shan Zhang, Teaching and Research Sectiont of Histology and Embryology, Fourth Military Medical University, 169 Changle West Road, Xi'an 710032, China. jszhang@fmmu.edu.cn
Received: April 15, 2003
Revised: May 10, 2003
Accepted: June 2, 2003
Published online: September 15, 2003

AIM

To induce apoptosis of human cultured hepatocellular carcinoma (HCC) cell line SMMC-7721 by GnRH-analog alarelin, and to provide the experimental evidence for GnRH-A in endocrinotherapy of HCC.

METHODS

MTT assay, transmission electron microscopy and DNA end labeling method were used to identify apoptosis of cultured human hepatocellular carcinoma cells treated by alarelin.

RESULTS

SMMC-7721 cell line was induced by alarelin in 10-9 mol/L concentration. The induction of apoptosis was dose-effect dependent. Under electron microscopy we could identify the earlier and later stage of apoptotic cells, and chromatin condensation, as well as apoptosis body formation. DNA end labeling method showed that alarelin could induce apoptosis of HCC cells (0.29±0.06 vs 0.11±0.03), and their apoptosis body formations were observed. Compared with control group, the TUNEL index was increased significantly in alarelin treated groups (P <0.05).

CONCLUSION

GnRH-analog alarelin can induce apoptosis of cultured human HCC cell line SMMC-7721, and it plays a potential role in the treatment of human HCC.

Key Words: N/A
0 引言

促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing-hormone-analog, GnRH)对垂体外的多种外周组织的生理功能均有调节作用[1-3]. 已有研究表明, 乳腺、前列腺、卵巢、垂体和胰腺发生的肿瘤细胞上有GnRH结合点, 促性腺激素释放激素类似物(GnRH-A)可抑制这些肿瘤的生长. 实验研究和临床观察均提示肝癌可能是一种性激素依赖性肿瘤, 有文献报道体外培养的人肝癌细胞上有GnRH受体, GnRH对该细胞系有生长抑制作用, 肝癌的发生、发展过程与细胞凋亡有十分密切的关系[4-17]. 为探讨GnRH-A对肝癌细胞生长抑制作用的机制, 我们采用体外细胞培养技术, 用MTT试验、电镜观察和TUNEL技术研究GnRH类似物-阿拉瑞林对肝癌细胞SMMC-7721增生和凋亡的影响, 以期为深入研究GnRH在肝癌细胞增生调控的作用机制和将GnRH类似物用于肝癌的内分泌治疗提供实验依据.

1 材料和方法
1.1 材料

人肝癌细胞株SMMC-7721由本校细胞工程中心提供. 培养于含100mL/L小牛血清(华美公司)的RPMI1640 (Gibco公司)培养液中, 37 °C, 50 mL/L CO2饱和湿度的培养箱中培养. 阿拉瑞林为白色粉末, 上海丽珠东风生物技术有限公司产品, 使用前用RPMI1640培养液配制成所需浓度.

1.2 方法

1.2.1 细胞毒性MTT实验 将对数生长期的SMMC-7721细胞记数后调整细胞浓度为1×104接种到96孔培养板, 100 mL/孔, 每组3孔, 细胞贴壁后, 每孔分别加入10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9及10-10 mol/L不同浓度的阿拉瑞林继续培养48 h, 以培养液为生存对照组, 每孔加 5 mg/L MTT (Sigma公司) 50mL, 再培养4 h, 然后加入DMSO150/孔, 振荡5 min后用酶标仪(490 nm)测定各孔的A值, 求出肿瘤细胞生长抑制率=(1-加药组A值/生存对照组A值)×100 %.

1.2.2 末端脱氧核苷酸转移标记TUNEL法 分别将浓度为10-10和10-5 mol/L阿拉瑞林处理SMMC-7721细胞48 h后, 消化并制成细胞悬液移入6孔培养板中, 放入盖玻片, 培养至细胞贴壁, 玻片经40 g/L多聚甲醛固定30 min, 0.01 mol/L PBS漂洗3次, 按细胞凋亡检测试剂盒 (博士德公司) 说明书操作. 细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞, 即凋亡细胞, 可见胞核裂解, 并可见凋亡小体. 光镜下观察, 计算TUNEL指数(阳性细胞数/总细胞数).

1.2.3 凋亡形态学观察 收集经阿拉瑞林处理后细胞, 离心沉淀, 常规固定, 透射电镜观察, 照相.

统计学处理 用精确x2检验分析实验数据, P <0.05为有显著差异.

2 结果
2.1 MTT法检测

随着阿拉瑞林浓度的升高, 对7721细胞的抑制率也增大, 呈剂量依赖型(表1).

表1 阿拉瑞林对SMMC-7721肝癌细胞增生活性影响的MTT试验结果(mean±SD).
GnRH-A浓度 (mol/L)A值抑制率(%)
1.0×10-50.19±0.1369.96±1.15
1.0×10-60.25±0.1458.22±0.78
1.0×10-70.38±0.1351.65±0.53
1.0×10-80.35±0.1045.13±2.47
1.0×10-90.48±0.1128.59±1.72
1.0×10-100.54±0.1215.78±3.58
0.0 (对照)0.62±0.15-
2.2 TUNEL 法检测

光镜下观察, 可见肝癌部分细胞呈TUNEL阳性反应, 阳性物质呈棕黄色颗粒主要位于胞核内, 且多有胞核形态改变, 体积变小、呈肾形(图1). 对照组、10-10 mol/L 和10-5 mol/L阿拉瑞林处理组SMMC-7721细胞的TUNEL指数分别为0.11±0.03; 0.29±0.06和0.26±0.04. 两经阿拉瑞林处理组与对照组之间均具有显著性差异(P <0.05); 10-10mol/L 和10-5mol/L阿拉瑞林处理组间未见明显差异(P >0.05).

图1
图1 肝癌细胞TUNEL染色阳性 ×400.
2.3 透射电镜观察

电镜下可见部分细胞体积缩小, 核固缩, 染色体密集于核膜下. 部分细胞表现为核膜消失, 染色体断裂, 核分裂成碎片, 在胞质中与退变的细胞器等成分一起, 形成凋亡小体(图2).

图2
图2 肝癌细胞中凋亡小体 ×8 700.
3 讨论

目前肝癌仍是严重威胁人类生命的主要疾病之一, 手术切除癌肿仍为肝癌众多治疗方案中首选, 但许多肝癌患者在确诊时已属于中晚期, 从而丧失了手术机会, 作为保守治疗的化疗和放疗的效果不佳、毒副作用大[18-21]. 近年来肿瘤的内分泌治疗作为一种高效低毒的治疗方法, 正引起肿瘤病理学家和临床医师的重视. 已有的研究表明, 乳腺、肺、结肠、子宫、肾脏和胰腺等组织发生的肿瘤细胞上均有GnRH结合位点, GnRH类似物(GnRH-A)可抑制这些肿瘤细胞的生长[22-24]. 传统观点认为, GnRH类似物对促性腺激素的降调节作用以及其所引起的甾体激素水平下降是GnRH-A被引入激素依赖性肿瘤治疗的理论基础; 然而最近的研究发现, GnRH-A对多种恶性肿瘤细胞的生长可能具有直接的抑制作用[25]. GnRH类似物包括GnRH激动剂及拮抗剂, 阿拉瑞林为人工合成的促性腺激素释放激素的九肽类似物, 为GnRH激动剂, 一些研究资料已经表明阿拉瑞林对多种肿瘤有一定的治疗作用, 但其作用机制尚不十分清楚. 我们的研究已经证明人肝癌组织细胞上有GnRH受体 [26]. 我们用体外细胞培养技术观察了LHRH-A对人肝癌细胞系SMMC-7721生长的影响, MTT细胞毒性实验结果表明, GnRH-A对SMMC-7721细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性, 将不同浓度的阿拉瑞林(10-10-10-5 mol/L)作用于SSMC-7721细胞株培养48 h, 在低浓度10-9 mol/L时即对细胞有抑制作用, 且随着浓度的增高, 抑制作用增强, 表明阿拉瑞林对体外培养SSMC-7721人肝癌细胞株有直接抑制作用, 且呈剂量依赖效应. 根据这一实验结果, 我们观察了10-10和10-5 mol/L两种不同浓度GnRH-A对肝癌细胞凋亡指标的影响. 应用形态学观察和末端脱氧核苷酸转移标记法证实, 阿拉瑞林作用后SSMC-7721细胞出现了细胞凋亡的典型生化和形态学特征.

迄今已有大量探讨肝癌细胞增生与凋亡机制的研究报道[27-32]. GnRH与性激素依赖性肿瘤细胞的增生调控有关, GnRH类似物已用于这些肿瘤的临床治疗. Yin et al [22]利用RT-PCR技术和Southern杂交法证明, 在人卵巢癌、肝癌(Hep G2)及绒毛膜癌 (JEG-3)等细胞中均有GnRH 基因的表达. 另外Pati et al [33]也证实在人肝癌细胞系HepG2 和 HuH7中有GnRH受体存在, 并且不同分子类型的GnRH对这两种细胞系的生长有抑制作用. 我们先前的研究表明[34], GnRH-A具有显著的体内抗肝癌细胞增生活性, 瘤内注射LHRH-A治疗使瘤体明显缩小, 治疗3 wk后, 抑瘤率可达57.7 %, 并且治疗组裸鼠的平均生存期明显延长; GnRH-A可使体外培养的hHCC和FSK-7902肝癌细胞Bax蛋白表达增加, 说明LHRH-A对肝癌细胞增生的调控与Bax有关. Westphalen et al [35]比较了阿霉素和AN-152 (LHRH类似物与阿霉素的连接体)对人卵巢癌细胞生长的抑制效应, 发现AN-152对LHRH 受体阳性卵巢癌细胞(EFO-21, EFO-27)生长的抑制效应显著高于阿霉素, 并且过量的LHRH受体激动剂可阻断AN-152的作用; 激光扫描显微镜观察到AN-152和阿霉素在癌细胞内的积聚; 而在LHRH 受体阴性卵巢癌细胞(SKOV-3), AN-152的效应则不及阿霉素, 并且癌细胞内也未发现有AN-152积聚, 这说明AN-152对卵巢癌细胞增生的抑制作用是由LHRH受体介导的. 综合本研究结果及已有资料, 我们推测GnRH-A抑制肝癌细胞增生的效应可能是由其受体介导的, 当GnRH-A与肝癌细胞上的特异性受体结合后, 启动受体介导的信号传递系统, 促使凋亡基因开放和表达, 从而使癌细胞周期分布改变, 引发细胞凋亡.

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