二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞生长的影响

摘要

目的

研究二烯丙基二硫(DADS)对人胃癌MGC803细胞生长的抑制作用.

方法

采用MTT法、生长曲线分析、细胞活力检测、双层软琼脂集落形成率、及倒置显微镜等方法, 观察DADS对体外培养的人胃癌MGC803细胞的影响.

结果

DADS对MGC803细胞具有明显的生长抑制效应, 且呈剂量-效应依赖关系(P <0.05). 培养96 h, 35 mg/L DADS的抑制作用呈时间-效应依赖关系(P <0.05). 细胞群体倍增时间由33.8 h延长至DADS处理后的84.0 h (P <0.05); 细胞存活率分别为阴性对照组97.4%和DADS处理组80.4%(P >0.05); 软琼脂集落形成率由1.23%下降到0.33% (P <0.05). 阴性对照组细胞多角形、圆形, 体积大, 多形性明显, 核大小不一, 见双核及核仁, 细胞生长紧密呈堆叠生长. DADS处理后细胞异型性降低, 为形态一致的梭形, 体积小, 境界清楚而分散, 胞质丰富, 核明显变小.

结论

DADS对体外培养的MGC803细胞具有明显的增生抑制作用, 且呈现剂量-效应依赖关系.

关键词: N/A

Inhibitory effect of diallyl disulfide on human gastric cancer cell line MGC803 in vitro

Liang-Yun Zhang, Hui Ling, Qi Su, Ying Song, Xia-Qiu Liang

Liang-Yun Zhang, Hui Ling, Qi Su, Ying Song, Institute of Oncology, Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province, China

Xia-Qiu Liang, Institute of Biophysics, Chinese Acanemy of Sciences, Beijing 100101, China

Supported by the Science and Technology Commission Foundation of Hunan Province, No. 97610319, No. 00SSY3019, and the National Natural Science Foundation of Hunan Province, No.01JJY2146, No.02JJY2026,

Correspondence to: Dr. Qi Su, Institute of Oncology, Nanhua University, Hengyang 421001, Hunan Province China. sq8888@cmmail.com

Received: October 17, 2002
Revised: October 23, 2002
Accepted: November 30, 2002
Published online: September 15, 2003

Abstract

AIM

To investigate the effect of diallyl disulfide(DADS) on human gastric cancer MGC803 cell line in vitro.

METHODS

The effect of DADS was confirmed by MTT assay, cell growth curve analysis, cell viability detection, clony formation in soft agar and inversion microscopy.

RESULTS

In vitro growth of MGC803 cells was significantly inhibited by DADS in a dose-dependent manner (P <0.05)when MGC803 cells were cultured for 96 hours , and at a higher concentration of 35 mg/L. The inhibiting effect of DADS displayed a time-dependent manner (P <0.05). Cell viability decreased from 97.4% in negative control group to 80.4% in treatment group. There was no significance existed between the two groups (P >0.05), and average doubling time was delayed from 33.75 h in negative control group to 84.0 h in treatment group (P <0.05).Clony formation ratio was also decreased from 1.23% in negative control group to 0.33% in treatment group (P <0.05). After treated by DADS, MGC803 cells showed plemorphic and atypia declining, small size, uniform spindle shape, abundant cytoplasm and smaller nuclei.All these appeared in 20 mL/L DMSO treated MGC803 cells as well as in DADS-expose cells.

CONCLUSION

The effect of growth inhibition of DADS on human gastric cancer MGC803 cells in vitro is Signifecant and exhibits a dose-dependent manner.

Key Words: N/A

0 引言

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一[1-9], 尤其在我国的发病率和死亡率仍居首位[10-12]. 流行病学调查显示, 食用大蒜可以减少胃癌的发生率与死亡率[13]. 研究表明, 大蒜及其烯丙基硫化物对结肠癌、白血病、乳腺癌、肺癌等均有明显的抑制作用[14-17]. 本室以前研究证实大蒜可以抑制MNNG诱发大鼠腺胃癌和癌前病变[18], 同时具有抗突变、抗癌变和促进淋巴细胞转化等功能[19-22], 并发现二烯丙基三硫(diallyl trisulfide, DATS)可抑制胃癌MGC803细胞生长[23]. 现研究不同浓度的二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)对体外培养的人胃癌MGC803细胞的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

MGC803细胞(为人胃低分化黏液癌, 山东师范大学生物系建株, 从湖南医科大学肿瘤所引进)用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640 (GIBCO)培养液置37 °C, 含50 mL/L CO₂, 恒湿、恒温培养箱中培养. 取对数生长期细胞, 按所需细胞浓度接种于培养瓶或培养板内, 待细胞完全贴壁6 h后, 换用含或不含药物的培养液培养至预定时间. 实验设立不同浓度的DADS (Fluka, d₄²⁰=1.0, M_r 146.28, 纯度80%, 含10-20% DAS)、DAS (Fluka, d₄²⁰=0.887, M_r 114.21, 纯度97%)处理组, 20 mL/L DMSO的阳性对照组, Tween 80+生理盐水溶媒对照组以及常规培养的阴性对照组.

1.2 方法

取对数生长期细胞, 接种于96孔平底培养板, 细胞贴壁6-8 h后, 加入处理因素, 继续培养96 h. 然后加入5 g/L MTT (AMRESCO) 20 mL液培养6 h即终止培养. 加入DMSO (SIGMA)振摇10 min, 以溶解细胞内外形成的甲簪, 置酶联免疫检测仪以空白对照组调零, 读取各孔A₅₇₀值(取6复孔). 按公式计算: 抑制率(IR%)=(1-实验组A₅₇₀值/0对照组A₅₇₀)×100%. 细胞活力检测采用台盼蓝排斥法, 倒置显微镜下计数活细胞与死细胞. 按公式计算: 细胞活力(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)100%. 双层软琼脂集落形成实验用三蒸水制备15 g/L和9 g/L两个浓度的低溶点琼脂糖溶液, 高温高压灭菌后维持于40⁰C水浴中; 同时制备3碦PMI1640培养液(含300 mL/L小牛血清和3倍双抗), 保存于37 °C温箱中. 临用时1:2混合琼脂糖与3碦PMI1640培养液, 调整细胞浓度使最终细胞接种量为1000个/孔. 每组3个平行样本, 2 wk后观察集落形成情况并计数集落数, 计算集落形成率. 取对数生长期细胞, 接种于24孔培养板. 每24 h取3孔细胞记数, 每孔记数4次, 求出三孔细胞的均值, 连续96 h绘制生长曲线. 肿瘤细胞群体倍增时间T_D按公式计算: TD=t×lg2/lg(N_t/N₀)(N_t为t时间的细胞数, N₀为初种细胞数). 对活细胞在接触处理因素前后细胞形态学及生长状况的变化进行动态观察.

统计学处理 采用SPSS10.0 for Windows统计软件进行方差分析、x²检验、协方差分析及Poisson分布分析, 确定P <0.05为差异有显著性统计学意义.

2 结果

2.1 MTT法测细胞的吸光度A₅₇₀

DADS浓度由20 mg/L-1增至45 mg/L时, MGC803细胞的生长抑制率由15.1%提高到65.8%, 呈明显的浓度依赖关系, 且表明DADS对MGC803细胞的IC₅₀在25-30 mg/L之间(表1). 方差分析显示, 各浓度组之间均有显著性差异(P <0.05). 根据表3的结果绘制DADS对MGC803细胞生长抑制效应量-效曲线图1. 当DAS浓度在40 -100 mg/L时, 对MGC803细胞生长具有一定的抑制作用, 抑制率由6%递增至20%(表2), 但浓度低于40 mg/L时, 其对MGC803细胞的生长几无影响. 在DADS溶液的实验浓度范围内, DAS最大含量为10 mg/L, 此浓度对MGC803细胞生长无影响. 可以认为DADS溶液对MGC803细胞的生长以抑制作用是由其单一成分DADS作用所致. DMSO对MGC803细胞的生长抑制作用也呈现出浓度依赖关系. 当DMSO浓度由1.0%增加到2.5%时, 生长抑制率由11.3%递增至57.5%. 方差分析, 各浓度组之间有显著性差异(P <0.05, 表3). DMSO对MGC803细胞的IC50值接近于2.0%. 本实验选取2.0%的DMSO作为阳性对照.

表1 DADS处理MGC803细胞96 h内的吸光度值(n =6).

	DADS (mg/L)
	0	20	25	30	35	40	45
mean±SD	0.73	0.62	0.46	0.34	0.27	0.27	0.25
	0.068	0.038	0.049	0.055	0.065	0.024	0.051
抑制率(%)	0.0	15.1	37.0	56.2	63.1	63.1	65.8

图1 DADS对MGC-803细胞生长抑制效应.

表2 DAS处理MGC803细胞96 h内的吸光度值(n =6).

	DAS(mg/L)
	0	10	20	30	40	50	60	80	100
mean±SD	0.54	0.52	0.54	0.54	0.54	0.51	0.49	0.48	0.43
	0.053	0.045	0.060	0.067	0.054	0.046	0.041	0.044	0.058
抑制率(%)	0.0	3.7	0.0	0.0	0.0	5.5	9.3	11.1	20.4

表3 DMSO处理MGC803细胞96 h内的吸光度A₅₇₀值(n =6).

	DMSO(mL/L)
	0	10	15	20	25
mean±SD	0.80	0.73	0.63	0.41	0.34
	0.089	0.061	0.076	0.069	0.036
抑制率 (%)	0.0	11.3	21.3	48.7	57.5

2.2 生长曲线及时间-效应曲线

根据细胞生长曲线(图2)绘制35 mg/L^-1 l, 25 mg/L^-1的DADS, 2.0% DMSO及Tween 80溶媒对MGC803细胞生长抑制作用的时间-效应关系曲线(图3). 2.0%DMSO对MGC803细胞生长抑制作用于72 h达到高峰(56.95%)而后下降, 呈现时间-效应依赖关系; DADS在35 mg/L^-1时, 随培养时间的延长, 细胞生长抑制率随之增加, 72 h后进入平台期, 呈现时间-效应依赖关系; DADS在25 mg/L^-1时, 随时间的延长, 细胞生长抑制率稍有增加而近成直线, 表明25 mg/L^-1的DADS对MGC803细胞生长抑制效应稳定, 与时间无关(P <0.05). Tween 80溶媒对MGC803细胞生长抑制作用于第24 h为最大, 而后随时间的延长, 其对MGC803细胞生长抑制效应逐渐降低.

图2 MGC803细胞生长曲线.

图3 DADS 对MGC803细胞抑制作用的时间效应.

2.3 细胞群体倍增时间和活力

常规培养的MGC803细胞群体倍增时间为33.8 h; 当DADS浓度由20 mg/L增加到35 mg/L时, 其细胞群体倍增时间由36.0 h延长到84.0 h, 表明MGC803细胞经DADS作用后, 其细胞群体倍增时间明显延长, 细胞增生周期延长, 从而细胞增生速度减慢. 20 mL/L DMSO也将MGC803细胞群体倍增时间延长至50.7 h, Tween 80对MGC803细胞群体倍增时间无影响(表4). DADS处理组细胞存活率比常规培养的MGC803对照组有所下降, 但无统计学差异(P >0.05); DMSO及Tween 80与常规培养的MGC803对照组间亦无差异性(P >0.05, 表5).

表4 处理前后MGC803细胞群体平均倍增时间.

参数	MGC803	DMSO	T80	DADS(mg/L)
				20	25	30	35
初种细胞数(×104)	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5	1.5
细胞记数(×104)	14.44	7.46	14.06	12.77	9.48	6.46	4.44
倍增时间(h)	33.75	50.74	34.21	35.99	42.90	56.99	83.96

表5 MGC803细胞存活率改变.

参数	MGC803	DMSO	T80	DADS (mg/L-1)
				35	30	25	20
死细胞数	7	10	13	22	38	28	100
活细胞数	261	130	247	117	156	172	559
细胞活力(%)	97.37	92.87	95.00	84.21	80.38	86.00	84.83

2.4 集落形成和镜检

经DADS和DMSO处理后的MGC803细胞集落形成能力明显降低. Poisson分布检验表明, 除20 mg/L DADS组, DMSO组与对照组细胞集落形成率无差异性(P >0.05)外, 25mg/L, 30mg/L, 35 mg/L DADS各组均有显著性差异(P <0.05, 表6). 未处理组与Tween 80溶媒组的细胞形态呈多角形、圆形, 细胞体积大, 边缘不清, 多形性明显; 胞质较丰富, 饱满而透亮; 核大小不一, 可见核分裂、双核及核仁; 细胞生长紧密甚至呈堆叠生长(图4). DADS与DMSO处理组细胞形态变化明显, 由多角形为主变为形态一致、以梭形为主, 胞质丰富透亮, 可见部分圆形漂浮的细胞, 其胞质内见许多颗粒; 大部分细胞体积小, 贴壁紧密, 分散存在, 细胞境界清楚; 细胞核明显变小, 未见核分裂(图5).

图4 未处理MGC803 细胞×20.

图5 DADS 处理后MGC803 细胞×20.

表6 软琼脂培养MGC803细胞克隆集落形成率.

	MGC803	DMSO	T80	DADS(mg/L)
				20	25	30	35
接种细胞数	1 000	1 000	1 000	1 000	1 000	1 000	1 000
mean±SD	12.33	8.67	13.00	10	7.67	4.33	3.33
	1.247	0.471	0.816	0.816	1.699	1.247	1.247
相对集落形成率(%)		70.32	↑5.4	81.10	62.21	35.12	27.01

3 讨论

DADS是大蒜主要有效成分烯丙基硫化物中的一类低分子量非水溶性化合物. 近年来研究表明, DADS对结肠癌、白血病、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤均有明显的抑制作用[14-17]. 关于DADS抗癌机制, 目前认为可能与其可明显增加GST、QR、EH等解毒酶的活性[24,25]; 刺激淋巴细胞增生, 增强巨噬细胞吞噬能力, 促进IL-2, TNF-α, IF-γ释放, 提高NK, LAK细胞活性; 阻断细胞周期演进, 使细胞停滞于G2期, 诱导肿瘤细胞凋亡[14-16] ; 干扰癌细胞信号传导途径, 影响癌基因与抑癌基因的表达有关. 而DADS对人胃癌细胞生长抑制的研究不多. 我们采用MTT法、生长曲线分析、细胞活力检测、双层软琼脂集落形成率及倒置显微镜等方法, 观察DADS对体外培养的人胃癌MGC803细胞的影响. MTT比色实验表明, DADS作用MGC803细胞后, DADS浓度由20 mg/L增至45 mg/L时, MGC803细胞的生长抑制率由15.1%提高到65.8%, 呈现浓度-效应依赖关系, 各浓度组之间均有显著性差异(P <0.05), DADS对MGC803细胞的IC₅₀在25 -30 mg/L之间, 且DADS浓度大于35 mg/L时, MGC803细胞的生长抑制率并不随DADS浓度增加而增加. 我们同时对DADS中所含DAS的作用进行了实验, 结果显示DAS浓度在40 mg/L以下时, 其对MGC803细胞生长无影响. 因而可以提示, DADS对MGC803细胞的生长抑制作用仅仅是单体DADS作用的结果. 集落形成率结果显示, 经DADS和DMSO处理后的MGC803细胞集落形成能力明显降低, 除20 mg/LDADS组、20 mL/L DMSO组无差异性外, 25mg/L, 30mg/L, 35 mg/L DADS各组与对照组均有显著性差异(P <0.05).

细胞过度增生, 分化与凋亡的阻遏是肿瘤的基本特征. 我们发现DADS在一定浓度范围内对MGC803细胞具有良好的生长抑制作用且呈剂量-效应依赖关系; 较高浓度(35 mg/L) DADS对MGC803细胞的生长抑制作用还表现出时间-效应依赖关系, 25 mg/L DADS则作用稳定, 与接触时间无关. MGC803细胞在DADS处理后其细胞群体倍增时间明显延长, 而细胞存活率与阴性对照之间无显著性差异, 表明DADS抑制MGC803细胞生长作用不是直接杀伤细胞而使进入分裂增生的细胞数量减少所致, 这与阳性对照的DMSO结果相一致. 综合形态学观察, DADS处理后MGC803细胞异型性降低, 为形态一致的梭形, 体积小, 胞质丰富, 核明显变小, 提示DADS可能具有诱导MGC803细胞分化的作用.

备注

$[Footnotes]

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