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世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1258-1260
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1258
乙型和丙型肝炎病毒对MAPKK信号转导的影响
张忠东, 成军, 钟彦伟, 张树林
张忠东, 成军, 钟彦伟, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 张忠东, 成军, 钟彦伟, 张树林. 乙型和丙型肝炎病毒对MAPKK信号转导的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1258-1260
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)的感染, 不仅引起急、慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生密切相关. 虽然HBV和HCV感染与肝细胞癌之间的关系已经得到确定, 但是具体的分子生物学机制还有许多工作要做. 肝炎病毒蛋白可以与自身结合形成同二聚体, 或者与病毒的其他蛋白、肝细胞蛋白结合形成异二聚体, 从而对肝细胞的生长、代谢及恶性转化产生影响[1,2]. 丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)是信号转导途径中的重要成员, 肝炎病毒蛋白与MAPKK作用可以改变信号转导, 可对细胞的分化、增生等产生影响.

1 MAPK的级联反应

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是介导细胞反应的重要信号, 普遍存在于多种生物, 包括酵母和哺乳动物细胞. 自1991年Sturgill et al [3]从动物细胞中鉴定出细胞外信号调节激酶(ERK), MAPK信号转导通路的研究取得迅速发展. 除ERK外, 还发现克隆了c-jun氨基末端激酶(JNK)/应激激活蛋白激活酶(SAPK)、p38和ERK5等MAPK亚族. 该激酶级联首先在促细胞分裂素所致的微管结合蛋白(MAP)激酶活化的途径中发现, 故称MAP激酶级联. MAPK级联的核心由3个Ser/Thr蛋白激酶: MAPK、MAPKK、MAPKKK组成.级联方向为MAPKKK-MAPKK-MAPK. MAPK信号转导通路采用高度保守的三级激酶级联转导信号, 细胞外刺激通过某些环节使MAPKK激活, 转化MAP激酶激酶(MAP kinase kinase, MAPKK), 然后通过对苏氨酸和酪氨酸双位点磷酸化激活MAPK. 细胞外刺激作用于细胞, 通过多级激酶级联使MAPK激活, 激活的MAPK可通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白、酶类等多种底物调节细胞生理过程. 因此, 促细胞分裂素刺激的胞内信号级联反应概括为4步连续反应: (1)Ras的活化; (2)Raf-1的活化; (3)MAPK级联的活化; (4)核效应. 哺乳动物细胞中, 存在三条平行的MAPK级联反应, 有ERK途径、JNK/SAPK、p38途径. 后两条途径主要对抑制细胞生长的刺激产生应答, 如化学制剂、渗透压改变、热休克、蛋白合成抑制剂、脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子(TNF)等. 三条MAPK级联的Ser/Thr蛋白激酶具有相似的一级结构、活化机制和被底物识别的最小序列(TYY). 同一刺激能引起不同的平行级联的应答, 表明这些平行的途径之间存在互相影响的通路. 三条途径重要的区别在于MAPK级联上游激酶活化的机制不同, ERK途径的MAPK级联上游激酶Raf-1被Ras直接活化, 在凋亡信号启动的细胞凋亡过程中, PAK65可能是JNK和p38途径的MAPK级联上游激酶, 受Ras的间接调节而被活化[4].

2 MAPKK活性的调节

除了蛋白酪氨酸激酶外, 在信号转导中起着重要作用的是丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶. MAPKK磷酸化并激活MAPK, 而MAPKK被上游的蛋白激酶如Raf、Mos和MAPKK激酶(MAPKKK)激活[5]. 最常见的如Raf-1, 是已知的许多激活MAPKK的细胞激酶之一, 在细胞对刺激产生增生响应的Ras信号转导通路中起着关键作用. 被激活的Ras(即Ras-GTP)就结合在Raf-1的N-末端域上. 在与Ras-GTP结合并且其酪氨酸被磷酸化后, Raf-1就激活MAPKK. 例如, 在白介素-2(IL-2)刺激下, Raf-1的酪氨酸被激活的SRC激酶(pp60SRC)磷酸化. 这个磷酸化作用对于Raf-1与Ras-GTP结合, 并激活激酶MAPKK是绝对必须的[6]. 许多因子都可以充分地激活Raf-1, 例如, 蛋白激酶C(PKC), ras-GTP和被激活的SRC激酶. 然而, 这些因子并不总是导致同样的最终结果, 相反地, 常常产生各种各样不同的响应. 比如, 蛋白激酶C将Raf-1磷酸化, 随后用佛波酯处理, 尽管这使得Raf-1的自身磷酸化增加了, 但是, MAPKK没有激活. 而一旦MAPKK被Raf-1激活, 他就会把目标瞄准MAP激酶的异构体. 这些胞质丝氨酸/苏氨酸MAP激酶的异构体, 即Erk-1和Erk-2被激活和向细胞核转移是信号转导通路上游Ras激活的最终结果. 如上所述, Raf-1激活了MAPKK, 后者则将MAPK的苏氨酸和酪氨酸磷酸化而将他激活. 然后, MAPK磷酸化, 并激活细胞核的转录因子, 包括c-myc、c-jun、c-fos、核因子-IL-6(NF-IL-6)、细胞质磷脂酶A2(cPLA2) 、表皮生长因子受体(EGF-R)和蛋白质激酶, 如c-Raf-1、MAPKK和p90rsk(蛋白磷酸酯酶-1, PP-1的糖原结合亚基)[4,6]. 用MEK2作为酵母双杂交的诱饵, 除c-Raf和KSR外, A-Raf是和MEK2作用的新配体. 体外结合实验证实了这种作用, 作用点位于代表A-Raf激酶区的255-606氨基酸残基(aa)末端[7]. Mos是生殖细胞特性的丝氨酸/苏氨酸激酶, 是卵母细胞成熟必需的. Mos刺激MAPK通过直接磷酸化和活化MAPKK, MAPK被双特异激酶MEKs激活[8]. MAPKK是一种双特异蛋白激酶, 磷酸化和激活MAPK, 本研究用四种鼠单克隆抗体(Y1-6、Y1-7、Y3-6和Y3-11)特异结合爪蟾MAPKK. 在体外Y1-6、Y1-7、Y3-6有效的抑制MAPKK活性. Y1-6抑制诱导的MAPK活性, 将其注入爪蟾卵母细胞可致生发中心破裂, 而突变的Y1-6却不能. 三种中和抗体 Y1-6、Y1-7、Y3-6与MAPKK的NH2末端1-23 aa结合, 而无中和作用的Y3-11与MAPKK的33 aa和67 aa结合. 合成多肽对应MAPKK的2-17 aa压抑野生型Y1-6的中和作用, 说明中和抗体结合MAPKK的NH2末端抑制MAPKK的激酶活性[9].

3 MAPKK的生物学作用

丝裂原活化蛋白激酶MAPK是介导细胞反应的重要信号, 普遍存在于多种生物, 包括酵母和哺乳动物细胞. 在哺乳动物细胞鉴定出细胞外信号调节激酶ERK, c-jun氨基末端激酶(JNK)/应激激活蛋白激活酶(SAPK)、p38和ERK5等MAPK亚族. 每种MAPK被不同的信号分子活化, 如ERK被MAPKK的MKK1、MKK2激活; p38MAPK被MKK3和MKK4-MKK6激活; JNK被MKK4激活[10,11]. JNK通过苏氨酸-183和酪氨酸-185的双磷酸化而被激活, MKK4是唯一的JNK信号转导通路的成员的MAPKK[12-14]. 生物化学研究证明MKK4磷酸化和活化JNK[12-14]. 然而MKK4的功能并不仅仅局限在JNK信号转导通路, 因为MKK4也磷酸化和激活p38MAPK[10,11]. MKK4激活JNK和p38MAPK的特性提供一种机制, 其说明用细胞因子或环境应激处理的细胞中这些MAPK活化的统一[15]. 然而活性统一不总被观察到, 如在肝中用氧化应激观察细胞内的新陈代谢和以AP-1为目标的蛋白-DNA复合体的形成, 证明肝中氧化应激下的JNK和p38MAPK的信号转导路径机制不同[16]. 原癌基因Raf的产物MAPKK1和MAPKK2在信号通路的功能影响细胞增生和分化. 其亚型以两种途径调节: (1)MAPKK1, 而不是MAPKK2被周期素依赖激酶p34cdc2磷酸化而失活; (2)p21Ras和Raf/MAPKK1形成三重复合体, 而不是和Raf/MAPKK2. 为进一步研究两种形式的调节和功能特性, 比较v-Mos的活化形式, 检测在培养细胞中介导的转录及形态学反应. v-Mos增强全部形式的酶活性, 约有600倍. MAPKK2变异可激活MAPKK1, 说明构象改变导致活性相似[17]. JNK的酪氨酸和苏氨酸磷酸化而被激活, 报道新的MAPKK家族的MKK7作为JNK的激活剂, 在体外证明MKK7磷酸化JNK, 而不是p38和ERK, MKK7在培养细胞中的表达激活JNK信号转导通路, 因此MKK7是JNK通路中的新成员[18].

4 乙型和丙型肝炎病毒与MAPKK的信号转导

MAPKK活性在表达HCV核心的细胞. MAPKK是JNK活化的上游调节剂. MAPKK活性的缺陷可显示下游JNK和AP-1功能的缺失. 在表达丙型肝炎病毒核心蛋白的细胞中观察到MAPKK活性被TNF诱导. 不同时间用TNF刺激对照和试验组. TNF处理30和60 min即可检测到磷酸化的提高. 随后, 对照组和转染HCV核心DNA的细胞组用TNF处理30 min, 磷酸化的MAPK 用Western blot分析. 在0.1 nmol/L的TNF处理时对照组的MCF-7细胞MAPK活化发生, 但是转染HCV核心DNA的细胞有高的基础活性而用TNF刺激不会进一步激活MAPKK[19]. HCV基因型1 a和3的核心蛋白激活MEK1及Erk1/2, 而且HCV核心的表达导致Raf1 和MAPKK高度活化, 体外实验证实Erk1/2和下游的转录因子Elk1对表皮生长因子(EGF)的反应延长[20]. MAPK在细胞分化、转化及应激反应中起着关键作用, HCV核心蛋白具有致癌作用, 在BALB/3T3表达的核心蛋白激活MEK-ERK通路, 为进一步说明其作用, 在几种细胞系瞬时表达核心蛋白, 用Gal4-Elk1萤虫素酶实验研究信号转导通路, 发现核心蛋白增强MEK下游的Elk1活化作用, 而不影响ERK活性和Elk1的磷酸化[21]. 乙型肝炎病毒X蛋白对病毒复制是必需的[22,23], 被广泛地认为是转录激活者[24]. X蛋白依赖他的亚细胞定位可以通过两种不同的机制刺激基因表达[25]. 许多依赖RNA聚合酶II启动子, 如包含AP-1和NF-κB位点的启动子, 在细胞质X蛋白刺激Ras-Raf-MAPKK (MEK)- MAPK级联反应和JNK通路的活化诱导其表达[26-28].

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