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世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1242-1245
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1242
乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白的研究
梁耀东, 成军, 陆荫英, 吴君, 程明亮
梁耀东, 成军, 陆荫英, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
吴君, 程明亮, 贵阳医学院第一附属医院感染科 贵州省贵阳市 550004
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 梁耀东, 成军, 陆荫英, 吴君, 程明亮. 乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白的研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1242-1245
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

基因组研究自从开展以来, 已经取得了举世瞩目的成就. 随着基因组测序工作的完成, 接下来就是研究基因的功能. 因为基因是通过蛋白质之间的相互作用而发挥功能的, 蛋白质之间的相互作用是很多生命现象的基础, 故基因表达的蛋白质的功能研究尤为重要. 乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒, 可以引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌等, 目前全世界有3.5亿人感染, HBV为了适应生存环境的变化, 特别是在宿主免疫和抗病毒药物的压力下, HBV的4个基因区都可能发生突变, 有的突变改变了病毒的致病性, 或影响宿主对病毒的免疫应答、抗病毒药物的疗效和乙肝疫苗的免疫效果, 治疗及预防效果均不佳, 且预后极差[1-7]. HBV的四个结构蛋白开放读码框(open reading frame, ORF) S、C、P、X分别编码前-S1、前-S2、HBsAg、HBcAg、HBeAg、病毒多聚酶及HBxAg等7种蛋白质, 1990年代末以来, 一系列的遗传、生化方法尤其是酵母双杂交技术等的发展, 为研究HBV与人体蛋白质之间的相互作用打下了坚实的基础.在上述七种蛋白中, 由于HBcAg结构和功能的特殊性, 目前对其结合蛋白的研究还比较少.

1 HBcAg的结构及功能

HBcAg由HBV的 C基因编码, 分子量为21-22 kD. C基因可分为前-C(pre-c)区和C区, 前-C区位于1814-1901 nt之间, 编码一段29个氨基酸残基(aa)组成的多肽叫前-C蛋白. C区位于1901-2450核苷酸(nt)之间, 编码183 aa组成的C蛋白(乙型肝炎病毒核心抗原, HBcAg), 而由前-C和C蛋白基因共同编码的212 aa组成的多肽, 称乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg). C基因有两个ATG起始码, 形成至少四条多肽(p25、p22、p21及p17)[8].

HBV核壳由240个或180个HBcAg亚单位组成对称的正二十面体结构, 各亚单位间必须有确定的分子界面方能形成如此特异的结构, 其内侧与P蛋白及基因组RNA结合, 外侧面与HBsAg结合. p21 HBcAg自C基因的第二个ATG起始合成, 是组成核壳的主要成分, 由183-185 aa组成, 除负责形成特殊的结构外, 尚参与RNA包装、DNA 合成、病毒成熟、识别包膜蛋白以及病毒向细胞外释放等过程. p22蛋白能够形成与p21 蛋白相似的核壳, 二者也可以形成杂交核壳. 核壳表面有特征性的刺突及核孔, 推测其基本亚单位为锤头状二聚物, 且折叠成放射状排列的四条α螺旋, 中间第78-82 aa是主要免疫区(MIR), 位于核壳刺突的尖部.除刺突外, 位于C -末端α螺旋尾部的127-133 aa, 是除刺突外的另一个B细胞识别位点. 尽管HBcAg不象其他许多病毒那样折叠成β片层, 但所形成的核壳仍具有许多功能信息.

HBcAg有稳定的三维结构, 大致可分为核壳装配区(1-149 aa)和核酸结合区(150-183 aa). HBcAg的双体在装配区自发地组装进入核壳, 有文献报道, 在大肠杆菌, 酵母和哺乳动物细胞中表达C基因, 均可得到27 nm的核心颗粒, 表明HBcAg不需任何其他蛋白的参与即可自我装配成核心颗粒; 核酸结合区是精氨酸富集区, 可与前基因组RNA结合, 将其包裹进入核心. HBcAg的羧基末端是与RNA/ DNA的结合区段, 也与DNA聚合酶的包装信号ε结合有关; 其具有鱼精蛋白样亲胞核性, 可介导细胞核内转运信号, 当大量HBcAg进入细胞核内后, 其他嗜肝DNA病毒表达的核壳蛋白都不能被转运至核内. HBcAg羧基端鱼精蛋白样精氨酸丰富区第150-183 aa很重要, 删除此段, 虽仍能形成颗粒样核壳, 与全长形成的核壳在高分辨率冷冻电镜下观察无明显差异, 但较不稳定, 并且通常为空壳. 应用核磁共振(NMR)分析HBcAg颗粒, 发现C-末端鱼精蛋白样区在颗粒内部的位置不固定. Metzger et al [9]研究还发现在第150 aa后有很大的容量连接其他蛋白, 仍能形成大颗粒.

Conway et al [10]通过HBcAg颗粒对蛋白酶耐性研究, 发现仅有的蛋白酶敏感区145-147 aa位于装配区与核酸结合区交界处, 这一区域形成臂状结构. 如果138位脯氨酸由甘氨酸所替代, 则能阻止HBcAg聚合成颗粒, 而替换第134、135和144位脯氨酸, 则对核壳的形成无影响.

Konig et al [11]研究辨认出两个相互作用区, 一为78-117 aa, 可能形成二聚体的界面; 二是113-143 aa, 与HBcAg多聚体的形成有关. Kratz et al [12]发现第73-94 aa之间对HBcAg自身装配并非必需, 在此区插入238 aa仍能暴露于核壳表面. Borisova et al [13]研究发现任意插入一个仅5 aa的前-S1序列, 如果删除HBcAg第79-88 aa, 可产生特异性抗前-S1蛋白免疫力, 而当未删除或删除过多的氨基酸(79-93 aa)时, 则免疫力很弱, 删除79-81 aa, 尽管仍能被抗-HBc多克隆抗体所识别, 已足以避免HBcAg原有的免疫原性.

HBcAg基因的进化最明显, 他是唯一未被其他基因覆盖的基因, 其与狨猴HBV(WMHBV)的HBcAg序列同源性约为85-87%. HBV按基因结构分为A、B、C、D、E、F 6个基因型; 根据核心基因又可分为I型和II型, 两种基因型的易变区分别为88-99和48-60 aa, 大致HBcAg 74-101 aa属于高变区[14,15].

HBcAg有较强的免疫原性, 对HBcAg的免疫应答反应在宿主对病毒的清除过程中可能有重要作用. HBcAg的表位主要决定于HBcAg的空间构型, 有研究表明, HBcAg的主要B细胞表位在第107-118 aa和77-82 aa等区段; T淋巴细胞表位是一些在亲水区的较小的(几个至几十个)寡肽; 细胞毒性T淋巴细胞的识别部位由第84-101 aa和第17-28 aa等区段组成.

2 HBcAg的结合蛋白

HBcAg可组成Dane颗粒, 并释放入血, 也可在肝细胞膜上表达, 或游离的HBcAg与抗-HBc-IgM特异性结合形成循环免疫复合物. HBcAg具有很强的免疫原性, 既是T细胞依赖性又是非T细胞依赖性抗原, 也是杀伤性T细胞识别并清除HBV感染细胞的靶抗原.

由于感染肝细胞中细胞质和核中存在核心抗原, 核心蛋白肝细胞内的分布与病毒的复制状态和疾病的活动状态高度相关. Huang et al [16]研究了HBV核心蛋白与肌动蛋白结合蛋白的C-末端区相互作用. 他们用核心蛋白的羧基末端研究与细胞蛋白的相互作用, 因为这一段和病毒的复制周期有关如RNA包装和DNA合成. 用酵母双杂交的方法筛选出了一个cDNA克隆编码人肌动蛋白结合蛋白的C-末端区-ABP-276/278, 这个相互作用均用体内外实验所证实. 另外, ABP-276/278 的C-末端区可以和核心蛋白的全长相互作用. 因为这个区域既存在于核心区也存在于前核心区, 所以HBV的核心蛋白和前核心蛋白都可以和ABP-276/278的C-末端相互作用. 与HBV核心蛋白相互作用的ABP-276/278 的最小区是C-末端的199 aa相应于ABPs中的间隔铰链区II的24个重复的第23重复区. HBV复制中ABP潜在功能和他在慢性肝炎患者中在病理改变中所起作用还在研究.

核心蛋白是人乙肝病毒核心颗粒的主要组成部分, 核心颗粒和核心蛋白在病毒的复制中起重要的作用, 包括RNA包装, DNA的合成及病毒包膜蛋白的识别等. 核心蛋白大部分是含磷蛋白, 如果不是, 则在核心蛋白C-末端的3个SPRRR序列中的丝氨酸残基发生磷酸化. HBcAg磷酸化后暴露出其核内定位信号, HBcAg与核小孔复合物结合进入核内, 因此HBcAg磷酸化是病毒基因进入核内所必需的. 在包装了病毒聚合酶和基因组RNA后, HBcAg开始发生磷酸化, 这可以作为基因成熟的一个信号.

Kau et al [17]从细胞内核糖体相关蛋白成分研究发现一种丝氨酸激酶能特异地结合和磷酸化核心蛋白的C-末端部分, 这一激酶被命名为核心相关激酶(Core-associated kinase, CAK), CAK可被激酶抑制因子如肝素及Mn2+等抑制, 而不被亚麻酸、DRB、H89及H7等抑制, 表明可通过蛋白激酶A和C- 将其区分开来; 其还可通过肝素琼脂糖CL-6B和磷酸纤维素P11柱来部分纯化; 通过Western 法检测出三种46、35、13 kD的蛋白质, 被证明与核心蛋白的C- 末端有作用, 且其仅仅在被洗脱部分含有CAK活性; 通过胶内(in-gel) 法激酶分析表明, 46 kD的激酶的相同部分能激活和磷酸化上述核心蛋白的C- 末端, 表明46 kD的CAK激酶最有可能是核心相关激酶, 同时还发现一种类似的46 kD激酶, 其表现为对CAK激酶的抑制. 在纯化的细胞内核心颗粒和细胞外42 nm病毒中, 均提示CAK是核心颗粒相关激酶的候选子.

乙型肝炎病毒HBcAg可以与46 kD的丝氨酸激酶结合而发生磷酸化, 乙肝病毒核心蛋白的磷酸化被证实对于前基因RNA组装入病毒核壳是很必须的, 但宿主细胞激酶对介导HBV的复制这必须的一步还没有被清楚了解. Daub et al [18]在人肝细胞瘤HuH-7细胞裂解物中发现两种激酶, Mr分别为95和115 kD, 他们能与乙肝病毒核心蛋白特异性结合并使其富含精氨酸的C末端磷酸化, 95 kD 的激酶通过质量光谱测定法纯化后, 发现其性质类似于SR 蛋白特异激酶1(SRPK1). 依据这一发现, 通过免疫印迹法鉴定出115 kD 激酶为SRPK2相关激酶. 两种激酶磷酸化乙肝病毒核心蛋白在体内外作用于同一丝氨酸末端; 而且, 在所有细胞裂解物内均发现有乙肝病毒核心蛋白激酶, 表明SRPK1和SRPK2的生物化学性质是相同的, 通过层吸法测量结合物, 我们也了解到他们既不是周期素依赖性蛋白激酶Cdc 2和 Cdk 2, 也不是蛋白激酶C. 多有文献报道乙肝病毒核心蛋白的磷酸化与乙肝病毒核心蛋白激酶的活性有关, SRPK1 和 SRPK2是在乙肝病毒感染过程中介导乙肝病毒核心蛋白磷酸化的最有可能的细胞内蛋白激酶.

在病毒成熟过程中, 核壳与外膜蛋白相互作用, 形成病毒颗粒分泌的信号. Poisson et al [19]通过体外实验发现前-S1蛋白的第13位氨基酸的C-末端可以与HBcAg有效的结合, 其他位点则不能结合; 而且, 还发现HBsAg的第56-80位氨基酸也能与HBcAg有效的结合, 这两种反应可能是乙肝病毒维持正常的形态功能所必需. 其具体作用, 有待作体内实验进一步证实.

本实验室近来通过酵母双杂交技术研究发现, HBcAg与线粒体核蛋白L41、NADH脱氢酶亚基4、细胞色素C氧化酶、细胞色素B等有相互作用, 支持HBcAg通过肝细胞线粒体介导HBV的复制和装配; HBcAg还可与金属硫蛋白相互作用, 推断可能是机体自身保护反应的一种, 是否具有阻断病毒复制、清除病毒的效应还需要进一步验证, 如果上述推断成立的话, 将为抗HBV治疗方法的寻找开辟新的道路, 以上结果本室将于近期内报道. 同时我们还发现HBcAg能与其他16种蛋白基因相互作用, 其中4种为未知蛋白基因, 其具体作用, 尚在研究中.

总之, 乙肝病毒HBV和体细胞中的多种蛋白有相互作用, HBV结合蛋白的研究为HBV的生物作用和相关疾病的发病机制的研究提供了线索, 说明了一些蛋白质与人体相互作用后所能导致的结果, 部分地解释了乙肝病毒对人体的作用形式为什么如此多样变化, 所引起的病理生理改变为什么如此广泛. HBV结合蛋白尤其是HBxAg对细胞的调节作用比较重要, 研究也比较多, HBcAg在细胞调节中也起到一定的作用, 但目前对其报道较少. HBcAg及其他乙肝病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用值得进一步研究.

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