0 引言
与其他的慢性病毒一样, 乙型肝炎病毒(HBV)与人类长期共存, 导致了彼此之间的相互适应. 针对HBV来讲, 为了生存, 就得不断进行适应生存环境的变化. 这种变化的内因是HBV DNA聚合酶不仅是DNA聚合酶, 而且还是前基因组RNA逆转录为子代DNA的逆转录酶. 这种逆转录过程和逆转录酶的活性, 因为不具备有效的校对功能, 因此可以产生众多的基因变异[1]. 但是, 这些已经发生的基因变异并不是都能存活下来, 而是经过了外因的选择. 在进行有效的免疫预防之前, 在应用干扰素α(IFNα)、拉米夫定等核苷类似物抗HBV治疗之前, HBV的生存仅仅是受到机体免疫系统的压力, 而目前HBV生存的环境则要经受更多的考验. 这些因素就是对HBV的选择压力. HBV在内因和外因的共同作用下生存, 这种生存环境的复杂性和不断变化, 造成了HBV基因的异质性(heterogeniety)与准种(quasispecies)的特点[2-5].
1 准种的基本概念
无论核酸成分为RNA还是DNA的病原微生物, 在自身复制过程中由于RNA聚合酶或逆转录酶缺乏严密的自我校读功能, 或同时在感染宿主的免疫压力或抗微生物药物的选择压力下, 其核酸成分在少数位点上发生突变是长期以来存在的一种十分常见的现象. 在长期的生存环境中, 早期来源于同一个祖先的病原微生物, 因为这种突变现象的不断累积, 就可能发展为核酸成分差别很大的病原微生物群, 以致造成核酸序列的显著差别, 最终逐渐形成不同的基因型(genotype); 如果某些核酸序列位点的改变导致其编码产物抗原性的改变, 就逐渐构成了微生物不同的血清型(serotype). 这就是病原微生物基因型和血清型形成的基本过程[6]. 但是, 对于感染单一病原体的具体患者来说, 在相对较短的时间内, 病原微生物核酸的突变则造成体内同时存有基因序列有微小差别的种群. 种群的各个成员之间, 其差别程度一般不会超过核苷酸总长度的2-5%, 这种差别不足以构成病原体不同的基因型或血清型, 但又的确存在着基因序列的差别, 这种现象就称为准种 [7]. 关于病原微生物的准种现象, 早期是在一些RNA病毒核苷酸序列变化的规律中发现的, 但是目前认为在DNA病毒中也存在这种所谓的准种现象. 不仅病毒基因组的变化存在准种的现象, 在幽门螺杆菌及其他一些病原微生物中也发现了准种. 看来准种的特点是病原微生物界一个普遍存在的现象.
2 乙型肝炎病毒的准种特点
关于病毒的准种特点的认识是从人免疫缺陷病毒(HIV)和丙型肝炎病毒(HCV)的研究中逐步形成的. 在慢性乙型肝炎病毒的感染中, HBV是否有准种现象, 一直没有引起人们的广泛关注. 我们的研究表明, 在慢性HBV感染患者中, 的确存在准种现象, 同时也得到了文献的证实. 我们首先研究了两个慢性HBV感染者血清中HBV DNA序列, 特别是相对保守的S基因区的核苷酸序列不均一性的特点. 设计了S基因(包括前-S1、前-S2和S区)的特异性引物, 以HBV慢性感染者血清提取物为模板, 以多聚酶链反应(PCR)技术扩增, 获得了1 400 bp的DNA片段, 将这种扩增的DNA片段尽可能多地克隆到T载体中以实现克隆化, 分别获得了29和28个克隆. 当以EcoRI/XhoI进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析时, 在每1例患者中至少发现5种以上的表现形式, 这种RFLP特点经核苷酸序列的测定得到证实. 对于所得到的克隆进行序列分析, 结果表明每个克隆之间的序列不完全一样, 但同源性在98%以上, 遗传学上高度相关[8-10]. 对于HBV其他的结构基因区如X基因、核心基因、逆转录酶区等以及调节基因区如SP1、SP2、CP和增强子基因序列的异质性进行研究, 都证实了HBV在慢性感染个体中是普遍存在的, 为慢性HBV感染者体内存在HBV DNA的准种特点提供了直接的分子生物学证据[11-16].
3 乙型肝炎病毒基因异质性和准种研究的意义
关于HBV基因的异质性和准种特点的研究, 对于HBV生物学特性及临床研究都有十分重要的意义. 因为在此之前对于HBV的研究, 大多是以独立的HBV进行研究的, 而很少将HBV作为一个病毒的群体进行审视. 引入群体的概念, 替代个体的概念, 以不断变化的动态观念代替静态观念, 使我们对HBV的认识更加深入而全面.
第一, 在HBV基因的异质性和准种的研究中, 发现了HBV基因序列存在着各种不同类型的基因突变, 包括缺失突变、插入突变、碱基颠换突变、以及准种等多种类型. 提示HBV在其复制的DNA-RNA-DNA的过程中, 由于存在着转录与逆转录的过程, HBV DNA P又缺乏校读功能, 因而存在基因变异. HBV DNA发生变异, 一方面是HBV DNA复制过程中存在校读偏差, 这是HBV DNA序列异质性存在的根本原因, 其次还要受到机体的免疫系统的选择力、抗病毒药物的选择压力等因素的影响. 变异是绝对的, 变异的程度和速度是相对的. 在研究中我们在外周血中还发现了具有反式激活功能的截短型表面抗原中蛋白缺失突变形式的存在, 这一点具有十分重要的生物医学意义. 因为在此之前, 关于具有反式激活功能的表面抗原中蛋白羧基末端缺失突变体都是在HBV DNA阳性的肝细胞癌组织中发现的, 而在外周血中发现这种羧基末端缺失突变的HBV表面抗原中蛋白是第一次, 为慢性HBV感染引起的肝细胞恶性转化的机制研究, 提供了新的研究方向[17,18].
第二, HBV基因异质性与准种特点的研究, 有助于对HBV DNA全基因序列的认识. 早在1979年HBV研究者就克隆了HBV DNA的全基因序列, 随后也有一些研究陆续报道了不同基因型和不同血清型的HBV DNA的全基因序列, 从GenBank中收录的HBV DNA全基因序列达300株, 但是, 从研究方法上来说, 绝大部分的研究, 或者由于当时技术的局限性, 或者对于HBV准种特点认识不够, 都是分段克隆的, 然后根据重叠部分的序列, 人工拼接完成HBV DNA的核苷酸全序列. 这种HBV DNA的全序列虽然对于当时的HBV 分子生物学研究起到了不可磨灭的推动作用, 但也存在着严重的缺陷. 如果把HBV DNA序列的准种特点考虑在内, 那么如果进行分段克隆时, 很可能得到来源于不同病毒基因的核苷酸序列, 每次克隆所采用的病毒模板是随机的, 很难通过控制实验条件保证扩增产物的模板来源于同一种病毒. 换句话说, 这样分段克隆的HBV DNA序列在自然界是不存在的, 这只是一种人工拼接的HBV DNA序列. 因此, 只有通过设计特异性引物, 做长距离PCR扩增, 一次获得全长的HBV DNA才能代表自然界存在的HBV DNA序列, 目前我们已经应用长距离PCR技术, 从HBV慢性感染者血清中获得了HBV DNA全基因序列. 这些HBV DNA的全基因序列已经被美国生物信息学研究中心建立的核甘酸数据库GenBank收录, 收录号为: AF363961、AF363962、AF363963、AF384371、AF384372. 虽然获得的HBV DNA全基因序列不一定就是该患者体内的优势HBV病毒株, 但却代表了真实存在的HBV DNA的全基因序列. 这种真正存在于自然界的HBV DNA序列的准确性是十分重要的, 目前关于HBV基因变异的研究及其临床意义得到了空前的关注, 但是HBV DNA序列的标准株或参考株是一个重要的前提, 真正全长的HBV DNA序列是一个重要的参考[19-24].
第三, HBV基因异质性与准种特点的研究, 有助于全面理解HBV基因突变的特点和规律. 如果从准种这一角度来看HBV的基因变异, 因为很难控制所得到的HBV基因片段总是来源于同一个病毒株, 因此, 关于HBV基因突变及其生物医学意义的研究方法应该谨慎选择. 如果仅仅是在病情变化前后或治疗前后, 对于少数的HBV基因片段进行序列分析, 然后据此做出HBV基因突变的结论是不可靠的. 因为本来在血清中的HBV的基因序列就是不一样的, 如果不能保证在研究过程中总能保证扩增获得的HBV基因序列来源于同一个病毒株, 那么这种基因序列的比较是没有任何意义的, 更不能做出这种基因突变的任何生物学和临床意义的解释. 在我们看来, 随着HBV病毒自身的突变, 以及感染宿主免疫压力的筛选, 以及抗病毒药物的作用与筛选, HBV种群会发生漂变(shift), 而针对个体病毒的基因序列的改变的意义并不显著. 因此, 关于HBV准种概念的引入, 使我们对于HBV基因突变的规律的认识, 更加深刻而准确[25-28].
第四, HBV基因异质性与准种特点的研究, 有助于研究和了解HBV DNA准种形成的原因以及与临床表现和转归之间的相互关系, 这是研究HBV DNA准种特点重要意义所在. 关于机体的免疫压力以及抗病毒药物的选择压力在HBV DNA准种形成过程中的地位和作用, 以及HBV DNA准种的形成与急性HBV感染的慢性化、慢性HBV感染的临床转归之间的相互关系的研究, 将为探索抗HBV感染的治疗方法研究提供重要线索. 在我们的初步研究中已经发现了处于相对优势的种群, 这是一种在机体免疫压力和抗微生物化疗药物选择压力下不断选择的结果. 在慢性HBV感染者体内, 随着机体免疫功能状态的不同, 特别是在应用不同的抗HBV化疗药物治疗以后, HBV的优势种群也发生变化, 这是HBV逃避机体免疫压力, 形成慢性HBV感染的重要机制之一[29-33]. 研究慢性HBV感染的治疗方法, 除了研究机体免疫状态的动态变化以外, 也要重视HBV准种特点以及优势种群的形成规律.
