病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1097-1101
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1097
乙型肝炎病毒基因组中前-x编码基因的界定
董菁, 成军
董菁, 成军, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
董菁, 男, 1969-02-07生, 河北省徐水县人, 汉族, 博士, 1993年第四军医大学毕业, 主治医师.主要从事乙型肝炎病毒分子生物学与病毒性肝炎治疗的研究. 发表论文25篇, 参编专著4部, 获军队科技进步奖1次.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No.98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No.01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15

目的

探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组存在前-X基因. 乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠, 是基因组序列高度集中利用的一个典型. 早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF), 本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较, 阐明基因组结构的特点, 并探索是否存在新型ORF的可能性.

方法

考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度, 我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术, 根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物, 自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列, 克隆入pGEM Teasy质粒, 挑选克隆进行全基因组DNA测序, 与其他HBV基因组序列进行比较.

结果

测序结果提示来源于2个患者的5株HBV全基因组核苷酸序列在X基因之前存在一ORF, 我们命名其为前-X(pre-X)区. 前-X区编码氨基酸与X蛋白融合表达, 序列为MGLGYWPSPPAWNLCGSSADPYCGTPSSLFCSQPVWS ETYRNRQLCCPLSQIHLLS. 该编码序列仅在adr血清型中有编码表现.

结论

在HBV基因组中存在有一新的ORF, 命名为前-X区, 该区可能是一种HBV血清型特异性编码区.

关键词: N/A
引文著录: 董菁, 成军. 乙型肝炎病毒基因组中前-x编码基因的界定. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1097-1101
Study on definition of pre-x region in hepatitis B virus genome
Jing Dong, Jun Cheng
Jing Dong, Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China , No. C03011402, No. C30070690; and the Key Science and Technology Brainstorm Project of PLA during the 9th five year plan period, No. 98D063; the Start-up Funds for Returned Overseas Students of PLA, No. 98H038; and the Science and Technology Brainstorm Funds for Young Scholars of PLA during 10th five year plan period, No. 01Q138; and the Research and Technology Foundation of PLA during 10th five year plan period, No. 01MB135.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center , Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA , Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

AIM

To identify the pre-X gene in HBV strains of Chinese patients.

METHODS

The whole HBV genome was amplified by long-distance and accurate polymerase chain reaction (LA-PCR) method from the serum of 2 patients with chronic HBV infection, and then the PCR products were cloned into pGEM Teasy vectors. Five clones of HBV genome were sequenced. Sequences of our finding were compared with other HBV genome sequence deposited in GenBank.

RESULTS

Pre-X region was found in the HBV genome of these 5 clones, just upstream to the X gene. The pre-X gene is 168 bp long, and can be translated with X gene in frame. The amino acids sequence of pre-X gene was as the following: MGLGYWPSPPAWNLCGSSADPYCGTPSSLFCS QPVWSETYRNRQLCCPLSQIHLLS.

CONCLUSION

Pre-X region may be a serotype-specific coding gene.

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)基因组全长3 200个核苷酸(nt)左右, 为部分双链DNA病毒. Galibert et al [1,2]于1979年发表了HBV基因组的第一个全长核苷酸序列, 长度为3182 nt, 血清型为ayw亚型, 我国学者[3-5]于1984年报道了中国大陆流行的adr亚型全序列. Galibert et al [1]最初的研究将HBV基因组划分出4个开放读码框架(ORF), 分别命名为S、C、P、X区. 1990年Loncarevic et al [6]克隆了一株adr血清型的HBV基因组, 发现了前-X基因, 并初步认为是adr血清型特异性的一段序列. Takahashi et al [7]于1995年的初步研究认为前-X区变异与肝细胞癌(HCC)的形成有关, 之后在1998年发表[8]的研究报告中发现来源于HCC患者的40个全HBV基因序列中, 有18株具有前-X基因, 且均为adr血清型.我们应用长距离并且精确PCR技术(long and accurate PCR, LA-PCR)研究了乙型肝炎患者血清中存在的HBV病毒子基因组, 证实前-X基因存在于中国大陆流行HBV株中.

1 材料和方法
1.1 材料

应用的LA-PCR试剂成套试剂均购自日本Takara公司, pGEM Teasy载体、玻璃奶试剂、和琼脂糖凝胶为Promega公司产品, 细菌JM109为本室保存, 蛋白酶K为Merck公司产品, 酚、氯仿、氨苄青霉素、X-gal等均为国产试剂.

1.2 方法

1.2.1 HBV全基因组的克隆与测序 见文献[9,10]. 简言之, 自诊断为病毒性肝炎, 乙型, 慢性[11]的2例患者采集静脉血, 蛋白酶K消化-饱和酚: 氯仿(1:1)抽提法提取200 μL血清中的HBV DNA. 参考文献[12,13]中改进的全长HBV基因组扩增方法, 设计引物为P1: 5'- CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3', P2: 5'- CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3'. PCR法扩增目的片段. 玻璃奶法回收PCR产物, 与pGEM Teasy载体连接.将重组质粒转入细菌JM109. 选择经鉴定pGEM Teasy内插入3.2 kb产物的菌落送检测序, 由上海博亚公司完成.测序结果存入美国国立卫生院GenBank中.

1.2.2 核苷酸序列分析 应用DNA SIS对获得的5个克隆进行了ORF判读, 并将推断的ORF翻译为氨基酸序列, 应用Vector 6.0版软件对推定的ORF核苷酸序列与氨基酸序列与已经存储在GenBank中不同血清型的HBV核苷酸与氨基酸序列进行比较, 血清型包括: adr[4,14]、ayr[15]、adw2[6]、adw4和ayw[1].

1.2.3 前-X区氨基酸序列比较 在美国国立卫生院(NIH)生物工程信息中心建立的门户网站, 应用BLAST软件, 以本研究证实的G683-A2编码的前-X区氨基酸序列进行搜索, 以寻找存储于GenBank中的表达前-X区基因的克隆.另将该段氨基酸序列在Vector 6.0版软件进行疏水性分析.

2 结果
2.1 HBV基因组核苷酸序列的测定

以2例乙型肝炎患者血清中抽提的HBV基因组为模板, 应用LA-PCR-TA克隆方法, 将实际存在的HBV基因组克隆到测序载体中. 经验证后, 选择5个克隆测序, 分别命名为G683-A1、G683-A2、G683-A3、G376-A6和G376-A7, 获得的HBV基因组核苷酸长度分别为3215、3182、3213、3215和3125 nt. 测序结果存入美国国立卫生院的GenBank中, 序列号为AF363961、AF363962、AF363963、AF384371和AF384372.

2.2 核苷酸序列的分析

5株克隆之间的比较提示: G683的3株克隆之间的同源性为97.5%, G376的2株克隆之间的同源性为96.6%. 按照Galibert et al [1]最初定义的X区分析5株克隆的X区ORF, 4株克隆编码155 aa, 一株由于发生终止密码子的替换突变, 导致编码长度延长至179 aa. 应用DNA SIS软件对上述5个克隆的ORF再分析过程中, 发现在5株克隆的X区的上游均有一ORF, 该区长168 bp, 与X基因融合表达. 我们为了排除选择样本的误差, 在GenBank中选择不同血清型的全基因序列进行比较, 选择的GenBank序列号为: D12980 (adr[11]): 3215 bp; G329616 (adr[4]): 3221 bp; X04615(ayr[12]): 3215 bp; X02763 (adw2[13]): 3221 bp; Z35717 (adw4): 3221 bp和G329640 (ayw[1]): 3182 bp. 结果发现克隆株G329616存在前-X区ORF. X04615在前-X区第一起始密码子ATG处由于核苷酸的替换突变而成为TTG, 克隆X02763、Z35717和G329640在前-X区第一起始密码子ATG均编码CTG, 因此不表达前-X多肽. 另一adr亚型克隆D12980在第一起始密码子ATG无替换突变, 但在第二起始密码子ATG之前出现替换突变, 而终止了前-X多肽的表达.

2.3 氨基酸序列的比较

前-X多肽氨基酸残基(aa)序列比较结果(图1). 新的ORF长度为168 bp, 编码56个aa, 克隆G683-A2编码的前-X基因推断的氨基酸残基序列为: MGLGYWPSPPAWNLCGSSADPYCGTPSSLFC SQPVWSETYRNRQLCCPLSEIHLLS.G 683的3个克隆在第10位编码脯氨酸(P), G376的2个克隆与克隆G329616编码组氨酸(H); G683的3个克隆在第38位均编码谷氨酸(E), 而G376的2株克隆与克隆G329616编码为赖氨酸(K). 以G683-A2编码的前-X多肽分析, 该多肽Mr 6200, 有15个疏水氨基酸残基, 24个极性氨基酸残基, 5个半胱氨酸(C). 此外, 该多肽还包含7个亮氨酸(L), 分别位于第3、14、29、45、49、54、55位, 以及9个丝氨酸(S)[16].

图1
图1 前-X基因编码多肽序列比较结果.

在美国国立卫生院(NIH)的门户网站, 应用BLAST软件, 以G683-A2前-X区编码的推断氨基酸序列进行搜索, 发现存储的19(18)个克隆有前-X区多肽序列, 氨基酸序列同源性为85-94%.

3 讨论

1979年Galibert et al [1]首次将HBV基因组全序列测序并发表出来, 当时即定位了4个ORF, 分别为C、P、S、X区. 之后我国学者[3,4]于1980年代解读了大陆HBV流行株(adr)的全基因序列. 目前在美国国立卫生院的GenBank中, 存储了200多HBV全基因组序列, 但多数学者对4个ORF分区的界定并无异议.

本研究利用LA-PCR-以TA克隆-测序技术展示了同一患者来源的HBV基因组不同克隆之间的变异程度, G683的3株克隆之间的同源性为97.5%, G376的2株克隆之间的同源性为96.6%, 证明患者血清内的序列是不完全相同的, 符合准种表现.本研究其他报道[17-25]证实了近年其他学者[26-31]提出的HBV准种假说.

本研究在分析所获得的5个克隆的过程中, 在X区之前发现还存在一个ORF, 长度168 bp, 编码56 aa. 以G683-A2编码的前-X多肽分析, 该多肽Mr 6200, 有15个疏水氨基酸, 24个极性氨基酸.应用DNA SIS软件的蛋白质分析功能分析了前-X和X基因的完全表达产物, 前-X区较以往认为的X蛋白多出一个小的亲水区. 前-X区编码多肽含有5个C, 可能形成多个二硫键, 易于产生新的二级结构. 如果该区被证明是真实存在的, 那么前-X和X蛋白(我们初步命名其为全X蛋白)与X蛋白有不小的差异. 前-X多肽含有24个极性氨基酸, 形成一个亲水功能域, 可能影响到整个蛋白的空间构象. 在对我们获得的5个克隆与甘人宝et al [4]报告的前-X多肽进行比较时发现, G683的3个克隆在第10位编码P, G376的2个克隆与克隆G329616[4]编码H; G683的3个克隆在第38位均编码E, 而G376的另3个克隆编码K. 这印证了我们[32,33]以前的关于HBV在不同患者体内存在个体化变异的报告.

我们应用了2种方法来证实前-X区的真实存在. 方法一是在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列, 应用DNA SIS软件重新确定其ORF, 结果发现甘人宝et al[4](1984年)揭示的HBV基因组序列中存在前-X区ORF. 其他亚型不表达前-X区多是由于前-X区起始密码子ATG发生替换突变所致, 其他亚型的克隆表现为TTG (X04615), 或CTG(克隆X02763、Z35717和G329640). 另一adr亚型克隆D12980保留了第一起始密码子ATG, 但在两个起始密码子之间由于发生替换突变, 而终止了前-X多肽的表达. 初步推定前-X区起始密码子处发生的替换突变可能是血清型特异性的. 方法二是利用NIH网站的BLAST软件, 将前-X区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索, 结果发现已经存入GenBank中的序列中, 有19个克隆中含有的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性, 分别为来自2组报道, 其中2个克隆是来自同一序列的不同解释, 另17个克隆均来自日本学者[8]对肝细胞癌(HCC)患者体内存在的HBV基因组分析所获得. 我们克隆的氨基酸序列与18例相关克隆的比较, 发现同源性为85-94%. 这些克隆的共性为: 一均为adr亚型; 二均克隆自HCC患者. 综合上述2种方法证实的结果以及我们的资料, 可以肯定前-X区是实际存在的.

我们认为多种资料的研究结果证明前-X区是事实存在的, 以往的研究认为该区的编码并不是一种普遍现象, 因而未加以重视. Zuckrman et al或其他教科书均未提及前-X区的存在, 仍沿用Gelibert et al建立的ORF划分方法. 我们分析的结果提示具有前-X区的HBV克隆株多来自日本和中国, 且均来自adr亚型, 而欧美学者由于选择的样本误差可能是忽视了该区域的主要原因. 另外, 由于目前仍缺乏对HBV的大规模分子流行病学资料, 因此早期发现前-X区的学者[6]可能认为一些位点发生变异, 而不认为这是一种主流现象, 因而未得到重视[34].

早在1990年Loncarevic et al [6]自HCC患者血液中克隆的adr亚型的HBV基因组中提及了前-X区, 作者简单介绍了前-X区的存在; Takahashi et al [7]于1995年的研究结果认为前-X区与HCC有密切关系. 1998年, Takahashi et al [8]自HCC患者体内克隆了40株HBV全序列, 其中38株为adr亚型, 其中18株含有前-X基因, 作者综合以往的资料, 认为前-X基因与HCC有密切的关系. 但上述资料分析的患者病例数较少, 结论需要进一步推敲.我们选择的患者为慢性乙型肝炎患者, 并不是HCC患者. 我们搜集的24株编码前-X基因的克隆均为adr亚型, 提示前-X区的存在可能是一种亚型特异性现象. 与HBV表面抗原大蛋白[35-37]一样, X蛋白是一个强的反式激活因子[38], 该蛋白反式激活作用不仅作用于病毒蛋白启动子, 更可以通过与癌基因的相互作用而调控细胞的分化[39-41]. 根据Takahashi et al [7,8]的观察, 该区与HCC密切相关, 是否提示全X蛋白较X蛋白有更强的反式激活作用, 还有待于进一步确定. 根据针对前-X多肽的氨基酸组成分析, 发现该区域含有多个S, 可能是磷酸化的重要区域, 与细胞内信号转导有关.

作为完整的基因, 以前确定的4个ORF有4个启动子, 分别为S启动子I、II(SP I和SP II), X启动子(XP)和C启动子(CP)[42-45], 前-X区位于既往定义的XP区. 启动子区定义的方法目前仍沿用报告基因表达调控法[46,47]所确定, 刘妍et al [48]以往的研究解释了不同准种克隆对CP的影响, 我们将应用这种方法进一步确定前-X之前是否存在有新的启动子区(XP II？), 并研究HBV异质性[49]对启动子区功能的影响.

总之, 在HBV X基因之前存在有一融合编码的ORF, 为前-X区; 如前-X多肽的表达得到进一步证实, 将对HBV感染的检测、全X蛋白的功能、HBV的致癌机制的研究均会产生重大影响.我们早先的研究探讨了X蛋白[50]不同变异株的反式激活作用的强弱, 下一步将探讨全X蛋白的反式激活作用.

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