病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1091-1096
在线出版日期: 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1091
乙型肝炎病毒基因组中前-前-S区编码基因的界定
董菁, 成军
董菁, 成军, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
董菁, 男, 1969-02-07生, 河北省徐水县人, 汉族, 博士, 1993年第四军医大学毕业, 主治医师. 主要从事乙型肝炎病毒分子生物学与病毒性肝炎治疗的研究. 发表论文25篇, 参编专著4部, 获军队科技进步奖1次.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No.98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No.01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15

目的

乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠, 是基因组序列高度集中利用的一个典型. 早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF), 本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较, 阐明基因组结构的特点, 并探索是否存在新型ORF的可能性.

方法

考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度, 我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术, 根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物, 自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列, 克隆入pGEM Teasy质粒, 挑选克隆进行全基因组DNA测序, 与其他HBV基因组序列进行比较.

结果

测序结果5株HBV全基因组核苷酸序列存在一新的ORF, 定义为前-前-S区, 并发现该区之前存在一TA富集区, 提示存在新型启动子的可能性. 新界定的前-前-S区ORF编码氨基酸序列为MQLIITSKLGIIYILCGRLVFY IREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS, 与前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白编码基因框架一致表达.

结论

在HBV基因组中存在有一新的ORF, 命名为前-前-S区.

关键词: N/A
引文著录: 董菁, 成军. 乙型肝炎病毒基因组中前-前-S区编码基因的界定. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1091-1096
Study on definition of pre-pre-S region in hepatitis B virus genome
Jing Dong, Jun Cheng
Jing Dong, Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China , No. C03011402, No. C30070690; and the Key Science and Technology Brainstorm Project of PLA during the 9th five year plan period, No. 98D063; the Start-up Funds for Returned Overseas Students of PLA, No. 98H038; and the Science and Technology Brainstorm Funds for Young Scholars of PLA during 10th five year plan period, No. 01Q138; and the Research and Technology Foundation of PLA during 10th five year plan period, No. 01MB135.
Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Gene Therapy Research Center , Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA , Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: March 8, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003

AIM

To investigate the new open reading frame (ORF) in hepatitis B virus (HBV) genome.

METHODS

The whole HBV genome was amplified by long-distance and accurate polymerase chain reaction (LA-PCR) method from the serum of 2 patients with chronic HBV infection, and then the PCR products were ligased into pGEM Teasy vectors. Five clones of HBV genome were sequenced. Sequences of our finding were compared with other HBV genome sequence deposited in GenBank.

RESULTS

A new ORF was found in HBV genome, just before Pre-S1 region. It was defined as pre-pre-S region. The pre-pre-S ORF was deduced to be translated with Pre-S1, Pre-S2 and S gene in frame. Its amino acids sequence was as the following: MQLIITSKLGIIYILCGRLVFYIREKLHAV PHFVGHHILGNKSYS. There was a TA-rich region before the ATG of pre-pre-S ORF, indicating a possible promoter for its transcription.

CONCLUSION

There is a new ORF pre-pre-S located upstream to pre-S1 region.

Key Words: N/A
0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)基因组全长3 200个核苷酸(nt)左右, 为部分双链DNA病毒. 1979年Gelibert et al 发表了HBV基因组的第一个全长核苷酸序列[1,2], 长度为3182 nt, 血清型为ayw亚型, 并在HBV基因组中界定了4个开放读码框架(ORF), 分别命名为S、C、P、X区. 之后各种血清型的HBV基因组均被测序成功[3-6], 并储存于GenBank中, 我国学者[7,8]在1984年将中国大陆流行的adr亚型克隆测序成功. 4个ORF中表达的氨基酸长度不同, 其生物学功能也不相同[9], 其中全S区又因不同的起始密码子(ATG)而又人为的分为前-S1、前-S2和S三个区, 前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白是按照同一开放读码顺序(in frame)进行翻译的. 我们应用长距离并且精确PCR技术(long and accurate PCR, LA-PCR)研究了乙型肝炎患者血清中存在的HBV病毒子基因组, 寻找新的ORF存在的证据, 并在既往已克隆的HBV基因组中得到了证实.

1 材料和方法
1.1 材料

应用的LA-PCR试剂成套试剂均购自日本Takara公司, pGEM Teasy载体、玻璃奶试剂、和琼脂糖凝胶为Promega公司产品, 细菌JM109为本室保存, 蛋白酶K为Merck公司产品, 酚、氯仿、氨苄青霉素、X-gal等均为国产试剂.

1.2 方法

1.2.1 血清来源和DNA分离 血清来源: 临床诊断为病毒性肝炎, 乙型患者慢性2例, 男女各1例, 编码号分别为G683和G376, 诊断均符合2000年西安会议《病毒性肝炎防治方案》 (试行)标准[10]. 临床检测表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、核心蛋白抗体(抗-HBc)阳性. 采集静脉血, 蛋白酶K消化-饱和酚: 氯仿(1:1)抽提法提取200 μL血清中的HBV DNA, -20 ℃保存备用.

1.2.2 多聚酶链反应(PCR)扩增目的片段 参考文献[11,12]中改进的全长HBV基因组扩增方法, 设计引物为P1: 5'- CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3', P2: 5'- CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3'.LA-PCR参数如下: 94 ℃预变性1 min, 94 ℃变性60 s, 55 ℃退火60 s, 72 ℃延长5 min, 共35个循环, 72 ℃再延长10 min.

1.2.3 克隆目的片段 将PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 切取长度为3.2 kb目的片段, 玻璃奶法回收PCR产物, 与pGEM Teasy载体连接. 将重组质粒转入细菌JM109, 氨苄青霉素和X-gal蓝白斑法筛选阳性菌落, 提取质粒进行限制性内切酶酶切分析鉴定.

1.2.4 DNA测序 选择经鉴定pGEM Teasy内插入3.2 kb产物的菌落送检测序, 由上海博亚公司完成. 测序引物为pGEM Teasy载体自有的T7、SP6测序引物, 同时根据测序结果设计测序引物进行序列测定, 测序引物包括: P1: 5'-AGA TAG GGG CAT TTT GTG GT-3'; P2: 5'-ACG GGA CGT AGA CAA AGG AC-3'; P3: 5'-GGT TTC ACA TTT CCT GTC TT-3'; P4: 5'-CAT ATC CCA TGA AGT TAA GG-3'; P5: 5'-AAC TAC ACG CAG TGC CTC AT-3'. 测序结果存入美国国立卫生院GenBank中.

1.2.5 序列分析 应用DNA SIS对获得的5个克隆进行了ORF判读, 并将推断的ORF翻译为氨基酸序列, 应用Vector 6.0版软件对推定的ORF核苷酸序列与氨基酸序列与已经存储在GenBank中不同血清型的HBV核苷酸与氨基酸序列进行比较, 血清型包括: adr[5,8]、ayr[4]、adw2[3]、adw4和ayw[1].

2 结果
2.1 HBV基因组核苷酸序列的测定

以2例乙型肝炎患者血清中抽提的HBV基因组为模板, 应用TA克隆方法, 将患者体内存在的HBV基因组克隆到测序载体中.经验证后, 选择5个克隆测序, 分别命名为G683-A1、G683-A2、G683-A3、G376-A6和G376-A7, 获得的HBV基因组核苷酸长度分别为3215、3182、3213、3215和3125 nt. 测序结果存入美国国立卫生院的GenBank中, 序列号为AF363961、AF363962、AF363963、AF384371和AF384372.G683的3株克隆之间的同源性为97.5%, G376的2株克隆之间的同源性为96.6%, 5株之间的同源性为93.6%.

2.2 核苷酸序列的比较

通过序列分析, 界定了4个主要ORF的长度, 其中按照Gelibert最初定义的S区分析5株克隆的全S区ORF, 包括前-S1、前-S2和主蛋白序列. 之后应用DNA SIS软件对上述5个克隆的ORF再分析过程中, 发现在前-S1区的上游有一未定义的ORF, 该区长135 bp, 与前-S1、前-S2和S基因按照同一开放读码顺序(in frame)进行翻译, 我们命名为前-前-S区. 为了排除选择样本的误差, 在GenBank中选择不同血清型的全基因序列进行比较.选择的GenBank序列号为: D12980 (adr [5] ): 3215 bp; G329616 (adr [8]): 3221 bp; X04615 (ayr[4]): 3215 bp; X02763 (adw2[3]): 3221 bp; Z35717(adw4): 3221 bp和G329640 (ayw[1] ):3182 bp. 结果发现克隆株G329616、D12980、X04615存在前-前-S区ORF. 前-前-S基因的起始密码子为ATG, 而克隆G329640为ATC, 克隆X02763、Z35717为AGG, 由于点替换突变导致表达终止.

对前-前-S区上游核苷酸序列分析, 发现存在一段TA富集区(TA-rich region), 在前-前-S区起始密码子ATG上游有3段TA富基序列, 无TATA-box结构, 为TATA样盒(TATA-like box), 分别为: ATG上游-8～-13: TATTAT; -17～-22: ATTAAA; -39～-46: AAATATTT.

2.3 氨基酸序列的比较

新的ORF长度为135 bp, 编码45个氨基酸残基(aa), 氨基酸残基序列为: MQLIIT SKLGIIYILCGRLV(A)FYIREKLHAVPHFV(A)GHHILGN KSYS, G683的3个克隆在第20和第30位均编码缬氨酸(V), 而G376的2株克隆编码为丙氨酸(A).甘人宝et al [8]、Mukaide et al [5]、Okamoto et al [4]发表的克隆株的前-前-S区第20和第30位均编码A. 以G683的3个克隆编码的前-前-S多肽分析, 该多肽Mr 5200左右, 有19个疏水aa, 10个极性aa, 5个强碱性aa, 1个半胱氨酸(C); 而G376的2个克隆编码的前-前-S多肽有21个疏水氨基酸残基. 本研究5个克隆的前-前-S-大蛋白与其他克隆的比较(图1).

图1
图1 前-前-S基因编码多肽序列比较结果.

在美国国立卫生院(NIH)的门户网站, 应用BLAST软件, 以G683-A1前-前-S区编码的推断氨基酸序列MQLIITSKLGIIYILCGRLVFYIREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS进行搜索, 发现存储的5个克隆有前-前-S区多肽序列, 分别为BAA32849、S43492、CAA25747、BAA89327和CAB38230, 氨基酸序列同源性分别为95%(43/45)、93%(42/45)、93%(42/45)、77%(35/45)和66%(30/45).克隆BAA89327来自大猩猩[13].

3 讨论

1979年, Gelibert et al [1,2]首次报告了HBV基因组的全序列, 并定位了4个ORF. 早期的研究学者大多采用将HBV基因组限制性内切酶消化后克隆入载体质粒中, 之后进行测序的方法获得的全序列. 我国学者[7,8]于1984年报道了大陆HBV株(adr)的序列. 而后的学者多利用重叠引物PCR法扩增HBV基因, 之后对PCR引物直接进行测序以揭示不同基因型、血清型之间的区别.目前在美国国立卫生院的GenBank中, 存储了200多HBV全基因组序列, 但之后的学者对4个ORF分区的界定并无异议.

1995年, 在分子生物学发展的基础上, Gunther et al [11,12]利用LA-PCR技术, 之后以TA克隆法将患者体内的HBV基因组克隆到质粒载体中, 该技术核心是应用DNA多聚酶具有3'-5'外切酶功能. 该方案保证了扩增片段与原模板之间的高度一致性, 又展示了模板多样性, 比Gelibert et al的研究方法简便, 易于操作. 本研究展示了同一患者来源的HBV基因组不同克隆之间的变异程度, G683的3株克隆之间的同源性为97.5%, G376的2株克隆之间的同源性为96.6%, 5株之间的同源性为93.6%, 各个克隆之间均存有一定差异, 证明患者血清内的序列是不完全相同的, 符合准种表现. 本研究其他报道[13-22]以及其他学者近期的研究结果[23-26]证实了1990年代初病毒学家[27,28]提出的HBV准种假说.

本研究在分析所获得的5个克隆的过程中, 在前-S1区之前发现还存在一个ORF, 长度135 bp, 编码45 aa, 命名为前-前-S区. 选择的GenBank中6个其他克隆株进行比较, 其中3个克隆具有前-前-S区ORF, 另3个克隆由于在前-前-S起始密码子的部位发生点替换突变而导致表达不能.应用DNA SIS软件的蛋白质分析功能分析了前-前-S、前-S1、前-S2和S基因的完全表达产物, 前-前-S区较以往认为的大蛋白多出一个小的疏水区. 如果前-前-S区被证明是真实存在的, 那么全S蛋白(含前-前-S区)与大蛋白有不小的差异. 其中的19(21)个疏水氨基酸在前-前-S区形成了一个小的疏水功能域, 可能与蛋白的空间折叠或表面蛋白合成后分泌有关.前-前-S多肽推断氨基酸序列中含有6个亮氨酸(L), 分别位于第3、9、15、19、27、39位, 前3个L是否可形成亮氨酸拉链结构, 尚需要进一步证实.

我们应用了2种方法来证实前-前-S区的真实存在. 方法一是在GenBank中选择不同血清型的HBV基因组全序列, 应用DNA SIS软件重新确定其ORF, 结果发现甘人宝et al [8]、Mukaide et al [5]、Okamoto et al [4]克隆的HBV基因组序列中均存在前-前-S区ORF. 方法二是利用NIH网站的BLAST软件, 将前-前-S区编码氨基酸序列输入后进行同源性搜索, 结果发现已经存入GenBank中的序列中, 有5个克隆中含有的氨基酸序列与本研究获得的序列有较高的同源性, 分别为: BAA32849[29] (1998年)、S43492[30](1990年)、CAA25747[31] (1983年)、BAA89327[13] (2000年)和CAB38230 (资料未发表, 1998年), 氨基酸序列同源性分别为95%、93%、93%、77%和66%. 综合上述2种方法证实的结果以及我们的资料, 可以肯定前-前-S区是实际存在的, 来源于不同的地域的HBV克隆株均有前-前-S区的明确编码. 前-前-S区ORF最早在1983年Fujiyama et al [31]克隆的adr亚型的S基因产物中被提及, 作者认为存在一身份不明的ORF(unidentified reading frame (s gene)); 而Mimms et al [32]将克隆S43492进行再分析后, 认为该段多肽是前-S1多肽内部, 他们认为的前-S1长度为164 aa, 而不是通常认为的119 aa或108 aa. 我们认为多种资料的研究结果证明前-前-S区的存在, 以往的研究认为该区的编码并不是一种普遍现象, 因而未加以重视. Bruss et al [33,34]界定了HBV表面抗原大蛋白的基因结构之后, 其他学者多认同这一观点, Gerlich et al [35]或其他教科书均未提及前-前-S区的存在.我们分析的结果提示具有前-前-S区的HBV克隆株多来自日本和中国, 欧美学者在最初的研究中获得的样本存在一定的偏差, 这可能是忽视该区域的原因之一. 另外, 由于目前仍缺乏对HBV的大规模分子流行病学资料, 因而早期发现前-前-S区的学者可能认为一些位点发生变异, 而不认为这是一种主流现象, 但我们自抽取其他学者获得的克隆中发现前-前-S区, 应当认为前-前-S区的存在不是一种个别现象, 至少在中国和日本是非常常见的. 由于HBV表面抗原不仅是病毒遗传结构的包装蛋白, 而且截短型表面抗原中蛋白[36,37]和大蛋白[38]具有反式激活作用, 这种功能与是表面抗原的多种形式激活癌基因有关[39], 我们的早期研究已经证明了HBV截短型表面抗原中蛋白和X蛋白[40-42]具有强大的反式激活作用, 进一步将研究前-前-S-大蛋白完全表达产物是否具有反式激活作用.

来源于G683的三个克隆在前-前-S多肽的第20和第30位均编码V, 而G376的2株克隆和甘人宝et al [8]、Mukaide et al [5]、Okamoto et al [4]发表的克隆株在这2个位点编码为疏水氨基酸A, 这印证了我们[43-45]以前的关于HBV在不同患者体内存在个体化变异的报告.

作为完整的基因, ORF之前应当存在启动子区域, 经过比较发现在前-前-S区上游存在一段TA富集区.在前-前-S区起始密码子ATG上游有3段TA富集序列, 无真核基因所特有的TATA-box结构, 仅有TATA样盒, 分别位于: TA1: TATTAT, ATG上游-8～-13 bp; TA2: ATTAAA, 上游-17～-22 bp; TA3: AAATATTT, 上游-39～-46 bp.如继续上溯, 在距前-前-S区ATG上游-79～-90 bp处有一长的TA区, 为ATTAAAATTAATT AT. 这段上游序列中是否具有启动子功能, 尚需要验证.在前-前-S区内, 存在前-S区启动子1(SP I)[46], 具有典型的TATA结构; 在前-S1区内, 存在SP II[47]. SP I和SP II分别调控既往定义的大蛋白和中/主蛋白的表达[48-50]. 我们的初步分析认为前-前-S区之前可能存在一启动子区, 如经实验证实其启动子作用, 其功能为调控前-前-S区与大蛋白的融合表达. 我们已确立了检测启动子活性的方法[51,52], 进一步的工作将验证SP III的存在.

总之, 在HBV前-S1 ORF之前存在有一融合编码的ORF, 我们将其命名为前-前-S区. 前-前-S区之前可能有一新的启动子区域(SP III). 如前-前-S多肽的表达得到进一步证实, 将对HBV感染的检测、疫苗设计、HBV进入肝细胞机制(受体学说)、表面抗原的表达过程及功能、宿主抗感染机制、HCC产生机制研究均产生重大影响.

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