修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
从中国慢性乙型肝炎患者的血清中, 应用长距离多聚酶链反应技术(L-PCR)技术扩增、克隆乙型肝炎病毒(HBV)的全基因组序列, 建立中国HBV流行株的参考标准序列.
从2例慢性乙型病毒性肝炎患者血清提取DNA, 以L-PCR技术对于3200 bp的HBV DNA进行扩增, 纯化后克隆到TA载体中进行序列分析. 对于HBV DNA的各个编码基因区进行分析.
克隆获得的5个HBV DNA全基因序列分别为G376-A6、G376-A7、G683-A1、G683-A2和G683-A3, 全基因序列长度分别为3125、3215、3213、3182和3 215碱基对(bp), 在GenBank中的注册号分别为AF384372、AF384371、AF363963、AF363962和AF363961. 其中G376-A6、G376-A7来源于同一个患者, G683-A1、G683-A2、G683-A3来源于另一个患者. G376-A6、G683-A2两株病毒在前-S1区存在缺失突变区. 其中G683-A2的羧基末端区存在缺失突变. 来源于不同患者的e/核心抗原蛋白质一级结构序列没有显著的差别, 但来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性. G376-A6、G683-A2两株病毒存在多聚酶蛋白区的缺失突变, 但不在多聚酶蛋白的活性结构区, 因此考虑这种形式的突变尚不会影响到多聚酶的活性. G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在较长的缺失突变区, 使其多聚酶区结构被破坏. 5株病毒的X蛋白的一级结构序列比较的结果说明其高度保守. 但是相对来讲, X蛋白的氨基末端更为保守, 羧基末端序列有一定程度的变异.
克隆了HBV DNA中国株的全基因序列, 可以作为研究中HBV流行株的参考序列.
引文著录: 成军, 董菁, 洪源, 钟彦伟, 刘妍, 王刚, 王琳. 乙型肝炎病毒中国流行株全基因的克隆与序列分析. 世界华人消化杂志 2003; 11(8): 1083-1090
Revised: March 20, 2003
Accepted: April 16, 2003
Published online: August 15, 2003
To clone and analyze complete genome sequence of hepatitis B virus (HBV) from the serum of Chinese patients with chronic hepatitis B and establish a reference HBV sequence for the study of HBV in China .
Long-distant polymerase chain reaction (L-PCR) technique was used to amplify the complete genome of HBV from 2 Chinese patients with chronic hepatitis B. After cloning into the TA vector and sequencing, 5 complete sequences were compared pairwisely.
The 5 complete HBV DNA sequences for G376-A6, G376-A7, G683-A1, G683-A2, G683-A3 were composed of 3 125, 3 215, 3 213, 3 182, 3 215 base pairs (bp) and deposited into GenBank by the accession numbers of AF384 372, AF384 371, AF363 963, AF363 962, AF363 961, respectively. Deletion mutation was observed in the pre-S1 region of the 2 sequences. G683-A2 genome encodes a truncated form of surface protein of HBV that could harbor trans-activation effects. The e/HBcAg coding sequences were well conserved from different strains of HBV. The defected HBV strain in polymerase coding region was observed indicating the co-existence of wild and mutated type of HBV in the serum of the patients with chronic hepatitis B. The X region was well conserved, but there was a variable region in the carboxyl termini.
Five complete HBV DNA sequences have been successfully cloned, and could be used as the reference HBV DNA sequence for the study of HBV in Chinese patients with chronic hepatitis B.
- Citation: Cheng J, Dong J, Hong Y, Zhong YW, Liu Y, Wang G, Wang L. Cloning and sequence analysis of complete genome of hepatitis B virus from Chinese patients with chronic hepatitis B. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(8): 1083-1090
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i8/1083.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i8.1083
乙型肝炎病毒(HBV)DNA的全基因克隆化早在1979年就已完成[1]. 此后, 随着1985年多聚酶链反应(PCR)技术的逐步建立和推广, 使得从慢性乙型肝炎患者血清中扩增、克隆HBV DNA的基因片段变得非常方便, 并逐步成为慢性乙型肝炎患者诊断以及抗病毒疗效判定不可或缺的检测和实验诊断手段[2-4]. 同时, 对于HBV DNA全长基因序列的研究, 使在美国国立生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库(GenBank)中注册的HBV DNA全基因序列达到200条以上[5-8]. 这些数据对于阐明HBV的分子生物学和分子流行病学都产生了积极的影响. 随着HBV DNA基因扩增技术的不断进步, 获得了大量关于HBV DNA基因序列片段的信息. 使得我们认识到乙型肝炎病毒其实是不完全相同的, 因此, 根据HBV表面抗原决定簇的序列和性质的不同, 可以分成不同的血清型(serotype), 根据全基因序列的分析又可以分成不同的基因型(genotype). 所以, 不同慢性乙型肝炎患者血清中的HBV DNA基因序列是不同的, 这早已经达成共识[9-12]. 对于同一个慢性乙型肝炎患者血清中的HBV DNA序列进行分析的结果却完全出乎意料. 同一个慢性乙型肝炎患者血清中的HBV DNA序列不仅不完全相同, 而且根本上难以找到序列完全相同的HBV. 因此, 对于这些序列进行仔细比较, 发现来源于同一个患者的HBV DNA序列虽然不同, 但是具有很高的同源性, 核苷酸序列的差别不超过总核苷酸长度的5%, 彼此之间有着显著的遗传相关性. 因此, 可以将这些基因序列显著相关, 而稍有不同的HBV可以看作是一个病毒的种群, 这一种群的个体之间序列差别较小, 又相互联系, 将这种现象称为准种(quasispecies)[13-16]. 这种序列不同, 有显著相关的HBV组成的种群, 其组成和比例又始终处于不断的变动状态, 其平衡的结果, 除了受到HBV复制的本身的一些因素之外, 还要受到HBV感染个体的免疫系统的状态、抗HBV药物的使用等因素的影响[17-20]. 准种概念的提出, 使我们对于HBV存在的状态的认识有了一个革命性的变革, 从个体的认识上升到对于准群的认识, 从静态的认识上升到了种群的的漂变(shift). 这一认知水平的提高具有十分重要的意义, 使我们认识到GenBank中收录的大部分HBV DNA基因序列都是分段克隆的, 代表的不是真正存在的HBV DNA的序列, 而是由来源于各种HBV DNA片段的一个嵌合体(chimera), 而真正这种序列的HBV是不存在的. 我们在研究抗病毒疗效与病毒基因变异之间的相互关系的研究中, 也不能仅仅从治疗前后单一的或少数几个克隆的序列的分析结果, 就判断治疗前后HBV DNA序列的变异, 或者与抗病毒疗效之间的关系. 无论是HBV DNA全基因序列的分析, 还是抗病毒治疗前后HBV DNA序列变化的分析, 我们必须有一个对照的标准序列, 或者说是参考序列, 为了建立HBV DNA中国流行株的全基因序列, 我们采取长距离PCR技术从2例慢性乙型肝炎患者的血清中进行了扩增和克隆, 得到5个全基因序列, 这些序列对于我们了解和研究HBV DNA中国流行株具有十分重要的参考意义.
诊断为病毒性肝炎, 乙型, 慢性患者2例, 诊断均符合2000年《病毒性肝炎防治方案》(西安). 临床检测HBsAg、抗-HBc、HBV DNA阳性, 其他肝炎病毒标志检测阴性. 采集静脉血, 蛋白酶消化, 饱和酚氯仿(1:1)抽提法提取血清中的HBV DNA, -20 ℃保存备用[21-24].
1.2.1多聚酶链反应(PCR)扩增目的片段 以甘人宝et al发表的序列为依据, 设计引物序列. 其上游引物为: 5'-GCC ATG CAG TGG AAT TCC ACA AC -3'(上游引物5'-端位于前S2的第一个鸟嘌呤上游3 nt处), 下游引物为: 5'-TCT CCA TGT TCG GTG CAG GGT CC -3', 目的片段长度约3 200 bp. PCR参数如下: 94 ℃预变性1 min, 94 ℃变性30 s, 68 ℃退火30 s, 72 ℃延长30 s, 共35个循环, 72 ℃再延长10 min[25-28].
1.2.2 克隆目的片段 将PCR产物在10.0 g/L琼脂糖凝胶中电泳, 切取目的片段, 玻璃奶法(博大公司)回收PCR产物, 与Promega公司所产生pGEM Teasy载体连接过夜. 将连接好的重组质粒转入细菌JM109, 筛选阳性菌落, 提质粒PCR(循环参数同前)、酶切鉴定[29-36].
1.2.3 DNA测序 根据PCR电泳结果, 每例患者选择2、3个扩增产物克隆株测序, 由北京赛百盛公司完成. 测序结果存入美国生物信息学中心的核苷酸序列数据库GenBank中[37,38].
我们在本项研究中, 从2例慢性乙型肝炎病毒感染者体内一共获得5株HBV DNA全基因组, 基因序列均在GenBank中注册. 5个克隆的名称、GenBank注册号, 以及全基因组的核苷酸序列长度见表1. 虽然各个病毒株全基因序列有一些差别, 但总长度在3200 bp左右. G376-A6、G376-A7病毒来源于同一个患者, G683-A1、G683-A2、G683-A3来源于同一个患者.
| 克隆 | GenBank注册号 | 大小(bp) |
| G376-A6 | AF384372 | 3 125 |
| G376-A7 | AF384371 | 3 215 |
| G683-A3 | AF363963 | 3 213 |
| G683-A2 | AF363962 | 3 182 |
| G683-A1 | AF363961 | 3 215 |
5株HBV DNA编码的表面抗原的蛋白质一级结构序列见图1. 这些序列包括表面抗原的前-S1、前-S2和S区. G376-A6、G376-A7、G683-A3、G683-A2、G683-A1 5种HBV基因所编码的表面抗原蛋白分别为370 aa、402 aa、402 aa、219 aa、402 aa. 从图1的序列中可以看出, G376-A6、G683-A2两株病毒在前-S1区存在缺失突变区. 5株病毒前-S2区序列相当保守, 仅见到前-S2区55个氨基酸残基的第16位上的氨基酸残基有变化, 来源于G683患者的G683-A3和G683-A1克隆为K, 而不是R. 5种HBV基因序列, 其中G683-A2的羧基末端区存在缺失突变, 根据HBV表面抗原的缺失突变与其反式激活结构的特点[39,40], 可以判定G683-A2基因编码的缺失羧基末端168个氨基酸残基的截短型(truncated)表面抗原蛋白具有反式激活(trans activation)功能. 来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性.
来源于不同患者的e/核心抗原蛋白质一级结构序列没有显著的差别, 但来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性. G376-A6、G376-A7在前-C区A83位点发生替换突变, 导致HBeAg无法表达(图2).
5株HBV的多聚酶蛋白质一级结构序列具有很高的同源性. G376-A6、G683-A2 2株病毒存在缺失突变, 但不在多聚酶蛋白的活性结构区, 因此考虑这种形式的突变尚不会影响到多聚酶的活性. G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在较长的缺失突变区, 使其多聚酶区结构被破坏, 这株病毒的多聚酶基因编码产物不具备多聚酶的活性. 这样的病毒之所以能够存在, 其自身不能编码有效的多聚酶蛋白, 尚需要其他病毒株编码的完整的多聚酶的反式辅助. 这是HBV多种突变体共存, 野生型HBV以反式方式提供缺陷型HBV所需要的条件, 辅助缺失突变HBV存在的重要机制, 也是HBV存在异质性(heterogeneity)的重要的分子生物学基础[41-44]（图3）.
一般认为HBV X蛋白的序列是比较保守的, 从我们的5株病毒的X蛋白的一级结构序列比较的结果来看的确如此. 但是, 相对来讲, X蛋白的氨基末端更为保守, 羧基末端序列有一定程度的变异. 这种变异形式包括多种类型, 如插入突变、缺失突变、点突变等[45-48]. G683-A3株病毒的多聚酶区在羧基末端的第32个密码子位点发生突变, 导致羧基末端的延长, 与野生型的X蛋白序列相比较, 多了24个氨基酸残基, 成为最长的HBV X蛋白. 其余都是点突变. 来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性(图4).
准种概念是于1978年在研究RNA噬菌体时提出的, 其概念是物种的基因组DNA或RNA的碱基序列在统计学上高度一致, 但个体之间又存有差异的一组群体. 其产生的原理是由于RNA多聚酶或逆转录酶不具有3'-5'外切酶活性, 校对功能缺如, 从而产生一群存在不同位点点变异的基因组DNA或RNA. 在宿主免疫压力的作用下, 或在药物的干预下, 准种群经过筛检, 遗留下优势种群耐受宿主内环境, 并继续变异. 1993年有学者分别独立的提出HBV存有准种的假说, 这是因为虽然HBV为DNA病毒, 但其生活史中必须经过逆转录阶段, HBV P区编码的多聚酶具有逆转录酶功能, 而无3'-5'外切酶校对活性, 经宿主免疫筛检, 并去除致死性突变, 遗留的准种群长期在体内存活并持续变异以适应宿主状况, 从而导致感染的慢性化. 近年来有少数研究证实了该学说[49-52]. 本项研究中, 我们克隆了5株HBV的全基因序列, 均属于adr血清型, 序列同源性分析结果也进一步证实了准种特点的存在.
在我们的另一项研究中发现HBV X区的25个替换突变表现为散在分布, 但相对集中于核苷酸序列的35-145 nt(8/25)和315-415 nt (10/25)两个区域, 因此导致氨基酸序列的35-36 aa和127-133 aa两区域发生多个点突变[53-58]. X区的缺失突变是相当常见的现象, 我们发现15个克隆中有5例(33.3%)发生缺失突变, 其集中于核苷酸序列的369-404 nt区, 导致123位氨基酸之后的X蛋白羧基端发生缺失, 甚至提前终止. 既往的研究表明X蛋白具有3个高度保守区, 分别处于1-20、58-84和98-140位氨基酸, 其反式激活作用可能与这3个区有关; X蛋白的二级结构含有4个α螺旋/卷曲, 4个β片层, 有一亮氨酸锌指结构(98-135位氨基酸残基), 该结构是X蛋白反式激活作用的基础结构. 人为的X蛋白缺失实验研究结果提示羧基端的移框突变或替换突变, 可导致反式激活作用消失, 尤其以132-145位氨基酸区重要, 但也有认为大的缺失突变不影响反式激活作用的报道. 我们的研究发现在5个缺失突变的克隆株的突变均影响了X蛋白羧基端的完整性, 破坏了亮氨酸锌指结构, 均发生在X蛋白基本结构区之内. 上述替换突变和缺失突变可能影响X蛋白的反式激活功能. 关于突变对反式激活作用的影响的研究正在进行中[59-64].
早在1990年前后, 有学者提出缺陷型HBV概念, 他们观察到在慢性HBV感染者体内存在有功能编码域发生变异, 导致HBV结构或非结构蛋白失去其功能, 从而影响HBV的感染能力和复制能力. 我们的初步研究中也观察到P区因突变而使得编码氨基酸序列被提前终止, 形成缺陷型HBV.
乙型肝炎病毒基因组编码的蛋白作为反式激活因子, 对肝细胞某些基因表达调控的影响, 可能是HBV致癌的主要因素. 早期研究多集中在整合的病毒DNA编码的HBxAg蛋白的功能上, 证实HBxAg蛋白是一种具有广泛活性的反式激活因子, 对乙型肝炎的慢性化和促进肝细胞的恶性转化有密切关系; 近年研究发现, 从肝癌细胞系或肝癌组织中亚克隆出的截短型前-S2/S基因表达产物羧基末端的截短型分子MHBst也具有反式激活功能. 人们笃信只有整合在肝细胞基因组中的HBV才编码截短型的MHBst, 在HBV相关性的HCC中具有重要作用. 我们第一次在外周血循环中检测到了MHBst的存在, 对于研究和了解MHBst在HCC形成过重的作用具有重要的意义. 我们构建了一种含有约500 bp MHBst167基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Mt, 该基因编码的MHBs 167位氨基酸残基以后的羧基末端截短. pcDNA3.1(-)-Mt瞬时转染COS-7细胞, 用前-S2单克隆抗体检测到截短型蛋白MHBst167的表达, 并且1:32倍稀释还可检测到MHBst167蛋白阳性. 与报告质粒pSV-lacZ共转染COS-7细胞, 明显促进β-gal的表达, 证明pcDNA3.1(-)-Mt能增强pSV-lacZ的SV40启动子的功能, 编码的MHBst167是一种反式激活因子, 而全长的MHBs无此功能[65-72].
目前研究表明, MHBst的反式激活效应可能与蛋白激酶C(PKC)依赖的信号转导途径有关, 前-S2区域与PKCα/β结合发生磷酸化反应, 触发PKC依赖的c-Raf-1/MAP2-激酶信号转导链式反应, 结果激活了转录因子如AP-1、NF-κB、AP-2、SRE、Sp1和c-myc、c-fos启动子, 参与病毒感染后的炎症反应和肝细胞癌的发生. MHBst蛋白结构的改变, 缺失了位于C-末端的膜定位信号, 使MHBst未能进入分泌途径而在内质网(ER)中滞留, 其前-S2区指向胞质区与胞质蛋白相互作用, 产生转录激活功能; 而全长的MHBs蛋白的前-S2区指向ER腔, 进入高尔基复合体而分泌. 所以说MHBst的反式激活功能依赖于其N-末端前-S2区的胞质定位功能. 而缺失突变的范围是决定该截短型分子是否具有反式激活作用的重要影响因素, MHBst至少完全缺失蛋白C-末端S区的疏水区Ⅲ, 才具有反式激活功能; S区的N-末端疏水区Ⅰ是反式激活所必需的, 因为蛋白与膜的结合是转录激活功能所必需的, 这段序列被称为"反式活性开启区"(trans-activity-on region, TAO)[73-78]. 进一步研究表明, MHBst的最小反式激活单元定位于4-53氨基酸残基, MHBst53是其中最小的转录激活因子, 是一种非膜结合类型的MHBst, 就是说, 仅前-S2区(aa 1-55)就足以介导反式效应, 说明作为反式激活剂的MHBst大小范围是很大的. 我们目前正在构建不同截短范围的表达载体, 进一步研究MHBst的反式激活功能, 筛选和克隆其反式激活的靶基因[79-85].
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