肠三叶因子在胃黏膜应激性损伤中的修复作用

摘要

目的

研究肠三叶因子(ITF, intestinal trefoil factor, 为三叶肽家族一员) 在水浸束缚应激(WRS)大鼠胃黏膜基因表达的变化, 探讨其在应激胃黏膜损伤中的修复作用.

方法

采用单次及单次和重复水浸束缚应激制作模型, 动态监测胃黏膜血流量(GMBF), 大体及光镜下观察黏膜损伤程度(UI)及组织学变化, 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测ITF基因表达变化, 免疫组化染色进一步证实ITF表达.

结果

单次应激造成胃黏膜广泛损伤, 但损伤指数在2、4、8 h逐渐减小, 至8 h降为64.9%, GMBF逐渐恢复, 至8 h上升为正常的89.8%, ITF基因表达增强(0.022±0.001 vs 0.177±0.010 P<0.01), 免疫组化染色计分为(0.134±0.001 vs 0.253±0.01, P<0.01); 单次和重复应激后胃黏膜产生适应性, 胃黏膜血流量上升, 损伤逐渐减轻, 4次应激后, 损伤指数降低为单次应激的22.0%, 胃黏膜血流量上升为正常的94.2%, 并且胃腺区细胞增生, ITF基因表达增强(0.040±0.001 vs 0.372±0.01, P<0.01), 免疫组织化学染色计分为(0.134±0.001 vs 0.354±0.07, P<0.01).

结论

ITF不仅可能参与胃黏膜早期重建(上皮移行), 还有可能参与胃黏膜慢修复反应(细胞增生).

关键词: N/A

Role of the ITF in repairing of stress-induced gastric lesions

Zhao-Shen Li, Shi-Nan Nie, Xian-Bao Zhan, Yan-Fang Gong, Zhen-Xin Tu, Guo-Min Xu

Zhao-Shen Li, Shi-Nan Nie, Xian-Bao Zhan, Yan-Fang Gong, Zhen-Xin Tu, Guo-Min Xu, Department of Gastroenterology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Center of Gastroenterology and Key Laboratory of PLA, Shanghai, 200433, China

Supported by: the Tenth-Five-Year Plan's Military Medical Scientific Foundation of PLA, No. 01Z059.

Correspondence to: Zhao-Shen Li, Department of Gastroenterology, ChanghaiHospital, Shanghai, 200433, China. zhsli @81890.net

Received: August 2, 2002
Revised: August 10, 2002
Accepted: August 16, 2002
Published online: July 15, 2003

Abstract

AIM

To determine the changes of ITF (intestinal trefoil peptides) expression in gastric mucosal and the effect on ulcer healing of ITF to WRS in rats.

METHODS

Wistar rats were exposed to single or multiple WRS for 4 h every other day for up to 6 days. Gastric mucosal blood flow(GMBF) was measured by LDF-3 Flow meter and the extent of gastric mucosal lesions were evaluated grossly and histologically. Expression of ITF mRNA was determined by RT-PCR. Immunohistochemistry was used to further detect the expression of ITF.

RESULTS

Single time of WRS produced numerous gastric mucosal erosions, but the number of these lesions gradually declined and GMBF restorated at 2, 4, 8 h after stress; the area of gastric mucosal lesion was reduced by 64.9% and GMBF was increased by 89.8% at 8 h, the healing of stress-induced ulcerations was accompanied by increased expression of ITF (0.022±0.001 vs 0.177±0.010 P<0.01), the results were demonstrated further by immunohistoch- emistry (0.134±0.001 vs 0.253±0.01, P<0.01). With repeated WRS, the adaptation to this WRS developed, the area of gastric mucosal lesions was reduced by 22.0% after four consecutive WRS, this adaptation to WRS was accompanied by increased GMBF(94.2%) and active cell proliferation in the neck region of gastric glands and by increased expression of ITF (0.040±0.001 vs 0.372±0.010 P<0.01), the result were demonstrated further by immunohistochemistry (0.134±0.001 vs 0.354±0.070, P<0.01).

CONCLUSION

ITF may participate in the early phase of epithelial repair known as restitution, but also may play an important role in the subsequent, protracted phase of glandular renewal.

Key Words: N/A

0 引言

胃黏膜损伤主要是通过损伤后早期重建(上皮移行)以及细胞增生而修复[1-3]. ITF (intestinal trefoil peptides)为三叶肽家族一员, 是一类较新的、对胃黏膜有保护作用的因子, 其对胃黏膜保护作用的机制可能在于增强受损黏膜周围完好上皮细胞向损伤黏膜表面迁移覆盖或与黏液中的糖蛋白相互作用, 加强黏液凝胶层, 抵抗黏膜表层有害物质等[4-9]. 目前尚无有关ITF与应激胃黏膜损伤修复关系进行研究的报道, 我们研究WRS大鼠胃黏膜ITF基因表达变化, 以探讨其对胃黏膜损伤修复的重要作用.

1 材料和方法

1.1 材料

ITF抗体购自意大利Asgiraud公司; RT-PCR相关试剂购自上海博彩生物有限公司采用单次水浸束缚应激大鼠胃黏膜损伤模型: 健康♂Wistar大鼠30只, 体质量约200 g. 随机分正常对照组(6只)和实验组(24只). 实验组又随机按0, 2, 4, 8 h 4个时间点分为4组(1-4, n = 6), 应激4 h后于0, 2, 4, 8 h分别测定相关指标及取材. 采用单次和重复水浸束缚应激大鼠胃黏膜损伤模型: 健康♂Wistar大鼠30只, 体质量200-220 g, 实验前1 d禁食, 自由饮水, 活动不受限. 实验前1 h禁水. 随机分正常对照组(6只)和实验组(24只). 实验组大鼠又随机分为4组(Ⅰ-Ⅳ, n = 6), 采用重复水浸束缚应激(WRS)制作模型[10], Ⅰ组, 1次应激, 大鼠禁食24 h后, 乙醚麻醉束缚于应激板上, 清醒后置于温度为20 ℃水中, 水面平胸骨剑突水平, 4 h后取出, 2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉, 于剑突下腹正中线切开腹腔并游离胃, 沿胃大弯剪开胃腔并使胃黏膜展开, 生理盐水漂洗3遍后分别进行GMBF测定、UI的判定及取材; Ⅱ组, 2次应激, 大鼠经1次应激后, 解除应激, 恢复正常饮食、饮水至第2天00:10时, 禁食24 h至第3天00:10时, 第2次应激, 4 h后取出, 20 g/l戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉, 于剑突下腹正中线切开腹腔并游离胃, 沿胃大弯剪开胃腔并使胃黏膜展开, 生理盐水漂洗3遍后分别进行GMBF测定、UI的判定及取材; Ⅲ组和Ⅳ组, 分别按上述程序进行第3次和第4次应激.

1.2 方法

LDH-3激光多谱勒血流仪开机预热30 min, 白色背景调零, 固定胃部, 在无血管区作一0.5 cm的横行切口, 插入血流计探头, 轻触黏膜面, 并与之保持垂直, 待血流稳定后, 在胃窦、胃体及大小弯取4点测定, 每点1.5 min, 取均值. 以多谱勒血流仪(mv)表示GMBF的相对值. UI的判定: 按Guth[11]标准积分: 点状出血为1分; 线状出血, 长度<1 mm为2分, 1-2 mm为3分, 2-4 mm为4分, >4 mm为5分, 宽度>1 mm 时分值×2. 在胃黏膜损伤明显处取0.5×1.0 mm组织块, 置于40 g/l中性缓冲甲醛液中固定24 h, 石蜡包埋, 行4 μm切片, HE染色, 观察黏膜组织学变化. 全胃剖开, 用1 g/l DEPC水反复冲洗胃腔至少3次, 小心剥离胃腺区黏膜, 分别放入冷凝管, 迅速放入液氮保存. 总RNA抽提按TRIzol^TM方法: 胃黏膜组织50-100 mg, 捣碎→加TRIzol^TM试剂1 ml→匀浆→氯仿0.2 ml→振荡15 s→离心(12 000 r/min)15 s→取上清液→加异丙醇0.5 mL→离心(12 000 r/min)15 s→70%乙醇洗沉淀→晾干. 取10 μg总RNA进行逆转录, 取1 μl逆转录产物进行PCR扩增, ITF正义引物序列为: 5'-ATGGAG ACCAGAGCCTTCTGGAC-3', 反义序列为: 5'-AGA GGTTTGAAGCACCAGGGC-3'[11], 退火温度为50 ℃, 扩增长度为221 bp, 同时加入β-actin引物作为内对照进行共同扩增反应. 在1%琼脂糖凝胶中电泳观察PCR产物并用计算机凝胶图像分析系统进行吸光度分析[12,13]. 免疫组织化学染色: 采用ABC法, 免疫组化染色阳性判定标准: 每只大鼠腺胃标本随机取2张切片, 每张切片分别观察胃腺上部、胃腺颈部及胃腺底部染色情况, 在高倍镜下随机取5个视野经图像处理仪进行定量灰度扫描, 在每个视野内各取10个细胞, 求其阳性信号平均灰度值, 将各值取倒数计分.

统计学处理 实验数据以mean±SD表示, 采用t检验, 两变量间关系运用直线相关分析.

2 结果

UI 单次应激: 造成胃黏膜广泛损伤, 但损伤指数在2、4、8 h逐渐减小, 至8 h降为正常的64.9%, GMBF逐渐恢复, 至8 h 为正常的89.8% (表1); 单次和重复应激: 胃黏膜产生适应性, 胃黏膜血流量上升, 损伤逐渐减轻, 4次应激后, 胃黏膜血流量上升为正常组的94.2%, 损伤指数降低为单次应激的22.0%(表1). 正常大鼠胃黏膜镜下见上皮完整, 腺体排列整齐, 黏膜层结构清楚. 1次应激4 h后显示出血性坏死灶呈火山口状, 几乎达黏膜肌层, 部分表皮细胞受损脱落, 黏膜下层明显充血、水肿. 重复应激后, 火山口状坏死灶明显减少、变浅, 黏膜下层充血水肿减轻, 4次应激后可见肉芽组织形成, 黏膜细胞呈增生状态, 黏膜层增厚, 腺颈区延长, 可见新生细胞形成.

表1 单次和重复应激后GMBF, UI, ITF染色强度及ITFmRNA表达变化 (n = 6, mean±SD).

应激	组别	GMBF	UI	Mean score	ITF/β-actin
单次	对照组	424.70±7.72	0.00	0.003±0.001	0.004±0.0 002
	应激组
	1	274.66±10.0b	45.32±2.41	0.134±0.001b	0.022±0.01b
	2	271.25±10.57b	38.62±1.53d	0.259±0.01bd	0.287±0.008bd
	3	397.21±10.81bd	31.18±1.28d	0.136±0.04ad	0.112±0.009bd
	4	381.43±9.45bd	29.44±1.17d	0.235±0.01bd	0.177±0.01bd
重复	对照组	484.01±10.97	0.00	0.003±0.001	0.004±0.0 004
	应激组
	Ⅰ	321.87±8.85b	47.23±1.20	0.134±0.001b	0.040±0.001b
	Ⅱ	418.35±7.94bd	30.54±1.12d	0.194±0.05bd	0.108±0.009bd
	Ⅲ	446.09±10.98bd	20.75±1.54d	0.281±0.015bd	0.265±0.009bd
	Ⅳ	455.95±11.81bd	10.39±1.18d	0.354±0.07bd	0.372±0.01bd

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 对照组; ^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 1 组或Ⅰ组.

2.1 免疫组织化学染色

正常时: ITF主要集中在胃腺颈部微弱表达; 单次应激后在0、2、4、8 h增强, 2 h达高峰, 免疫组化染色计分为0.134±0.001 vs 0.253±0.010 P<0.01(表1): 单次和重复应激后: ITF在胃腺颈部黏膜增生带表达增强, 单次应激与4次应激后免疫组织化学染色强度计分为0.134±0.001 vs 0.354±0.070 P<0.01(表1).

2.2 RT-PCR检测ITF mRNA表达

单次应激后在0, 2, 4, 8 h基因表达逐渐增强P<0.01, (表1); 单次和重复应激后, ITF基因表达增强, 单次应激与4次应激后为(0.040±0.001vs 0.372±0.010 P<0.01)(表1, 图1, 图2).

图1 单次应激后不同时间点ITFmRNA表达. M DNAMarker(bp); 1 对照组; 20 h组; 32 h组; 44 h组; 58 h组.

图2 重复应激后不同时间点ITFmRNA表达. M DNAMarker(bp) 1 对照组; 2 Ⅰ组; 3 Ⅱ组; 4 Ⅲ组; 5 Ⅳ组.

单次应激: GMBF与 UI成负相关(r = -0.901, P<0.01). 单次和重复应激: ITF与UI成负相关(r = -0.965, P<0.01), GMBF与UI成负相关(r = -0.953, P<0.01), ITF与GMBF成正相关(r = 0.854, P<0.005).

3 讨论

本结果提示, 正常时几乎没有表达, 但当应激后大鼠胃黏膜即有ITF表达, 于2 h达高峰. 大量证据表明, 三叶肽家族也在维持胃肠道黏膜的完整性及在加速损伤黏膜修复的过程中起重要作用. 在急性胃黏膜损伤后, 黏膜屏障被破坏, 肌体需要快速修复来保护胃黏膜, 使其免于被消化酶和胃酸消化. 这种修复在急性损伤后几分钟就开始了. 早期修复的关键过程就是细胞迁移, 以重建上皮的完整性和重组胃黏膜的完整性. 本实验中, 水浸束缚应激胃黏膜损伤中, ITF在胃黏膜中呈时间依赖性表达. 在应激期ITF有过表达, 随后进一步增加, 2 h达高峰. 短时间内, ITF基因增强先于EGF和TGF表达, 表明其也许介入早期愈合过程并且可能激发其他生长因子的表达. 在应激胃黏膜损伤后立即有ITF过表达并刺激细胞移行, 这点表明ITF可以看作黏膜损伤的快速反应肽, 在黏膜修复的早期阶段上调表达, 可能调节急性胃黏膜损伤早期愈合即重建.

在本研究中, 单次应激造成黏膜的最大损伤, 重复应激后, 损伤逐渐减轻, GMBF逐渐改善, 并且在此过程中伴有黏膜细胞增生及ITF、TGF_α基因表达增强, 说明此二者参与了适应性细胞保护. 在单次和重复水浸束缚应激大鼠胃黏膜产生适应性保护过程中, ITF基因表达逐渐增强, 并且ITF、基因表达增强在胃黏膜细胞增生之前, 这说明ITF参与了细胞增生反应. 目前, ITF在适应性细胞保护中作用机制仍未完全阐明. ITF为三叶肽家族一员, 其结构是6个半胱氨酸残基形成3个链内二硫桥, 似3片叶子一样结构, 又称P结构域, 现有大量证据表明三叶肽在胃黏膜的保护和修复中发挥重要作用. 当胃肠道发生溃疡时, 三叶肽表达增多, 同时在慢性溃疡附近区域存在一个特有解剖结构: 溃疡相关细胞系(UACL), 其伴有包括ITF在内的3种三叶肽等的表达. ITF通过调节细胞增生而使胃黏膜具有防御和修复功能, 其对不同细胞系具有促有丝分裂作用. 由此推测, ITF可能参与胃黏膜细胞有丝分裂, 使细胞增生, 从而修复胃黏膜.

总之, ITF不仅可能参与胃黏膜早期重建(上皮移行), 还有可能参与胃黏膜慢修复反应(细胞增生).

备注

$[Footnotes]

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