病毒性肝炎 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 955-958
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.955
丙型肝炎病毒核心蛋白上调层粘蛋白B1链基因启动子表达活性的研究
杨倩, 刘妍, 成军, 王建军, 杨艳杰, 张树林
杨倩, 刘妍, 成军, 王建军, 杨艳杰, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗中心北京市 100039
杨倩, 女, 32岁, 广西桂平人, 博士研究生, 主要从事传染病临床与基础研究工作.
张树林, 西安交通大学第一医院传染科陕西省西安市 710061
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No.C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-02-20
接受日期: 2003-03-21
在线出版日期: 2003-07-15

目的

探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对层粘蛋白B1链(LAMB)启动子转录的激活作用.

方法

以我室构建的HCV核心蛋白反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果为基础, 利用生物信息学技术确定LAMB的启动子区域(LAMB-p), 聚合酶链反应(PCR)扩增LAMB-p, 克隆至真核表达载体pCAT3中, 构建pCAT3-LAMB-p表达载体; 以该质粒转染COS-7、NIH 3T3细胞系, 用酶联免疫黏附方法(ELISA)法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性; 与pcDNA3.1(-)-core共转染NIH 3T3细胞系, 用ELISA法检测CAT的表达活性.

结果

质粒pCAT3-LAMB-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达; 共转染实验中pCAT3-LAMB-p+pcDNA3.1(-)-core组CAT的表达活性是pCAT3-LAMB-p的3.3倍.

结论

构建的pCAT3-LAMB-p具有启动子活性; HCV核心蛋白对LAMB-p有激活作用. 本研究为利用SSH技术研究HCV核心蛋白致肝细胞癌机制提供新的实验及理论基础.

关键词: N/A
引文著录: 杨倩, 刘妍, 成军, 王建军, 杨艳杰, 张树林. 丙型肝炎病毒核心蛋白上调层粘蛋白B1链基因启动子表达活性的研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 955-958
Up-regulating effect of hepatitis C virus core protein on laminin B1 chain gene promoter
Qian Yang, Yan Liu, Jun Cheng, Jian-Jun Wang, Yan-Jie Yang, Shu-Lin Zhang
Qian Yang, Yan Liu, Jun Cheng, Jian-Jun Wang, Yan-Jie Yang, Shu-Lin Zhang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. C03011402, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of PLA, No. 98H038
Correspondence to: Jun Cheng, MD, PhD, Professor, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: January 11, 2003
Revised: February 20, 2003
Accepted: March 21, 2003
Published online: July 15, 2003

AIM

HCV core protein is a potential transactivator for a broad spectrum of hepatocellular genes. To investigate activity of HCV core protein on laminin B1 chain promoter, we use co-transfection methods and reporter gene expression in hepatoblastoma cell.

METHODS

LAMB-p sequence was identified in GenBank by bioinformatics and amplified from HepG2 genome by polymerase chain reaction (PCR). The amplified product was cloned into pCAT3 vector. The NIH 3T3 and COS-7 cell line were transfected by pCAT3-LAMB-p, the NIH 3T3 cell line was co-transfected by pCAT3-LAMB-p and pcDNA3.1(-)-core. The choloraphenical acetyltransferase (CAT) activity was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit.

RESULTS

In all cell lines, we found pCAT3-LAMB-p had higher activity of CAT than pCAT3-basic by ELISA kit. The expression of CAT in co-transfection was 3.3 times as higher as that of pCAT3-LAMB-p plasmid.

CONCLUSION

HCV-core protein has transactivity on LAMB promoter, and this result is implicating in the pathogenesis of fibrosis related to HCV infection

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)基因组是一种单股正链RNA, 全长约9500个核苷酸(nt), 含有一个大的开放读码框架(ORF), 编码3010-3033个氨基酸残基(aa)的多肽前体, 多肽前体至少被加工为10种结构蛋白和非结构蛋白, 其中核心区(1-573 nt)编码的21 kDa HCV核衣壳蛋白(191 aa)是一种多功能蛋白质[1], 近年来研究发现, 核心蛋白可以定位于细胞核内, 并对多种病毒和细胞基因起调节作用[2-4]. 我室利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)筛选出HCV核心蛋白上调表达的一些已知和未知的基因, 其中包括层粘连蛋白B1链(LAMB, laminin B1 chain)基因. 本研究利用生物信息学手段对LAMB基因5'上游调控序列进行分析、克隆, 并与报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)构建表达质粒, 与核心蛋白表达载体共转染, 证明核心蛋白对LAMB启动子具有激活作用, 使下游CAT基因的表达增强.

1 材料和方法
1.1 材料

大肠杆菌JM109, 细胞株COS-7、NIH 3T3、pcDNA3.1(-)-core为本室保存. pGEM-T、pCAT3载体购自Promega公司, 脂质体FuGENE6购自Roche公司, Taq DNA聚合酶购自鼎国生物公司, 限制性内切酶Kpn I、Xho I购自Takara公司. 质粒DNA提取试剂盒(Promega公司), 玻璃奶DNA回收试剂盒(博大公司), CAT ELISA试剂盒(Roche公司). 引物合成、核苷酸序列测序由上海博亚公司完成.

1.2 方法

1.2.1 LAMB启动子结构分析 根据GenBank中LAMB基因组序列, 确定LAMB的翻译起始点, 截取其上游798 bp, 设计并合成引物, 在上下游引物的5'端分别加上Kpn I和Xho I.上游引物: 5'-GGT ACC GTC GCG CCCATC CCA AGC TC-3'下游引物: 5'-CTC GAG ATG CCG GTC CCC TGC AGC CA-3'.

1.2.2 质粒构建 PCR扩增 LAMB启动子序列, 玻璃奶纯化回收DNA片段, 在T4 DNA连接酶的作用下, 与pGEM-T载体连接, 转化大肠杆菌JM109, 挑取在选择平皿(Amp, X-gal/IPTG)生长的白色菌落提取质粒, 经酶切(Kpn I/Xho I)及测序鉴定. Kpn I/Xho I双酶切重组质粒pGEM-T-LAMBp, 玻璃奶纯化回收酶切产物, 定向克隆至pCAT3载体, 构建成重组质粒pCAT3-LAMBp. 经双酶切及菌落PCR鉴定连接产物. 试剂盒方法提取质粒以备转染.

1.2.3 细胞培养及转染 COS-7、NIH 3T3细胞系在含10%小牛血清的DMEM培养液中生长. 细胞生长至50-80%时采用脂质体转染法, 具体转染方法参照FuGENE6说明书进行. 质粒pCAT3-p转染30 h后收获细胞.

1.2.4 共转染实验 NIH 3T3细胞生长至50-80%时, 质粒pCAT3-p与pcDNA3.1(-)-core、质粒pCAT3-p与pcDNA3.1(-)空载体共转染. 具体转染方法参照FuGENE6说明书进行. 转染30 h后收获细胞.

1.2.5 CAT表达量的检测 将收获的细胞进行裂解, 提取上清液, 取200μl用于检测CAT的表达量. 具体方法严格按照CAT ELISA试剂盒说明书进行. 在415 nm光波下测吸光度A值.

2 结果
2.1 LAMB启动子结构

根据GenBank中LAMB基因组序列, 确定LAMB的翻译起始点, 选取其上游798 bp, 其核苷酸序列见图1. 对此序列进行分析发现有多个TATA盒存在, G+C含量为65%, 同时含有多个CCGCCC序列.

图1
图1 LAMB翻译起始位点上游核苷酸序列.
2.2 重组质粒的构建

以来源于HepG2细胞的基因组DNA为模板, PCR扩增LAMB启动子DNA序列, 结果如图2所示, 于790 bp处出现理想条带. 将扩增产物与pGEM-T载体连接, 双酶切鉴定, 结果如图3所示, 显示两条带(3000 bp的pGEM-T载体和790 bp的LAMB-p DNA片段), 并送测序鉴定正确. 双酶切产物与pCAT3载体连接, 双酶切鉴定如图4所示(4000 bp的pCAT3-basic空载体和790 bp的LAMB-p DNA片段), 连接转化生长的菌落进行PCR鉴定, 如图5所示, 于790 bp处可见理想条带.

图2
图2 以HepG2基因组DNA为模板, PCR扩增LAMB启动子序列.
图3
图3 pGEM-T-LAMBp双酶切(Kpn I/Xho I).
图4
图4 pCAT3-LAMB-p双酶切(Kpn I/Xho I).
图5
图5 pCAT3-LAMB-p菌落PCR.
2.3 重组质粒转染实验及报告基因CAT的检测

将重组质粒pCAT3-LAMB-p转染COS-7、NIH 3T3细胞, 如表1所示, pCAT3-LAMB-p具有启动子活性.

表1 pCAT3-LAMB-p转染COS-7、NIH 3T3细胞中后CAT的表达.
组别质粒吸光度(A值)
阴性对照 COS-7pCAT3-basic0.050
阴性对照NIH 3T3pCAT3-basic0.060
阳性对照COS-7pCAT3-control1.258
阳性对照NIH 3T3pCAT3-control0.258
实验组 COS-7pCAT3-LAMB-p1.046
实验组 NIH 3T3pCAT3-LAMB-p0.129
2.4 重组质粒pCAT3-LAMB-p与pcDNA3.1(-)-core共转染COS-7并检测报告基因CAT的表达

共转染pCAT3-LAMB-p+pcDNA3.1(-)-core时CAT的表达较对照质粒明显升高, 如表2所示, 说明HCV核心蛋白对LAMB启动子具有激活作用.

表2 pCAT3-LAMB-p+pcDNA3.1(-)-core共转染后CAT的表达.
组别质粒吸光度(A值)
阴性对照组pCAT3-basic-0.059
阳性对照组pCAT3-control0.138
实验对照组pCAT3-LAMB-p0.338
共转染组pCAT3-LAMB-p+pcDNA3.1(-)-core1.006
3 讨论

丙型肝炎病毒(HCV)易在感染个体中形成持续感染状态, 并容易发展为慢性肝炎、肝硬化(LC), 甚至肝细胞癌(HCC)[5-7], 其确切的机制仍不明确. HCV核心蛋白是一种多功能蛋白质, 除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外, 还具有多种调控细胞、病毒基因表达、细胞生长以及免疫调节等功能[8,9]. 实验研究显示核心蛋白对细胞信号转导途径, 尤其是NF-κB、AP-1和SRE相关途径具有明显的反式激活作用[10-12]; 在HepG2细胞中, 核心蛋白激活人胰岛素样生长因子II(IGF-II)基因、和SV40早期启动子[13-15]; 核心蛋白还能抑制或增强p53基因启动子功能[16,17]. HCV核心蛋白的反式激活功能在HCV致病中发挥重要的作用, 研究其作用分子生物学机制有助于理解HCV感染的慢性化和致癌作用. 我室采用抑制性消减杂交方法[18]克隆HCV反式激活基因. 成功地构建了HCV核心蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库. 其中发现HCV核心蛋白可上调LAMB基因的表达[19]. 为了进一步研究HCV核心蛋白是否对LAMB的表达有激活作用, 根据GenBank中LAMB基因组序列[20], 确定LAMB的翻译起始点, 截取其上游798 bp核苷酸序列进行克隆, 并构建含报告基因CAT的重组质粒, 结果发现HCV核心蛋白对LAMB的表达确有激活作用, 证实了cDNA消减文库的发现.

层粘连蛋白是细胞外基质成分, 主要存在于基底膜的透明层, 对细胞的黏附、移行和增生均有影响[21,22]. 层粘连蛋白由A、B1、B2三条链组成. 其中LAMB是其主要的活性区域, 含有与分布在肿瘤和上皮细胞上的受体高度亲和的配体区[23-25]. 虽然一些正常实质细胞能够表达层粘连蛋白[26,27], 但Geerts et al[28]利用原位杂交技术在正常鼠肝细胞中未发现层粘连蛋白mRNA的表达. 目前研究表明, 层粘连蛋白参与肿瘤的血管形成, 促进肿瘤的转移[29,30]. HCV核心蛋白上调LAMB表达的生物学意义并不明确, 但由于层粘连蛋白参与血管基底膜的形成及促进肿瘤的转移, 可能与肝纤维化、肝硬化时肝窦血管化及肝癌的扩散有关. 本研究为进一步探讨HCV感染的发病机制、HCV核心蛋白致癌的分子生物学机制提供新的研究基础.

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