基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因

摘要

目的

乙型肝炎病毒(HBV)基因组编码的HBxAg是一种很强的反式激活(transactivation)病毒蛋白, 在正常肝细胞的恶性转化(transformation)以及肝细胞癌(HCC)的形成过程中具有十分重要的作用. 为了阐明HBxAg的表达对于肝细胞基因表达谱的影响, 我们应用基因芯片技术, 对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.

方法

以含有全长乙型肝炎病毒基因的pCP10质粒作为模板, 应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的HBxAg基因片段, 常规分子生物学技术构建HBxAg的真核表达载体pcDNA3-HBxAg, 利用脂质体转染技术转染HepG2细胞, HBxAg蛋白的表达以Western blot杂交技术证实. 从转染和非转染细胞HepG2中提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 并进行基因芯片技术分析.

结果

经过限制性内切酶分析和序列测定, 证实pcDNA3-HBxAg构建正确. HBxAg在HepG2细胞中的表达以Western blot杂交技术得到证实. 对于HBxAg重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱, 利用基因芯片技术进行分析. 结果表明, 16种基因的表达水平上调, 58种基因的表达水平下调. 这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导等基因, 相信这些类型的基因在HBxAg的恶性转化中具有十分重要的作用.

结论

HBxAg是一种病毒反式激活蛋白, 对于肝细胞基因表达谱有显著影响; 基因芯片技术是分析病毒反式激活蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径.

关键词: N/A

Screening and identification of genes transactivated by hepatitis B virus X protein by microarray assay

Jun Cheng, Yan Liu, Yuan Hong, Jian-Jun Wang, Qian Yang

Jun Cheng, Yan Liu, Yuan Hong, Jian-Jun Wang, Qian Yang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing, China

Supported by: Grants from National Natural Science Foundation No. C03011402, No. C30070689, and Returned Scholarship of General Logistics Department of PLA.

Correspondence to: Dr. Jun Cheng, Professor, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, 302 Hospital of PLA, 100 Xisihuanzhong Road, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn

Received: January 11, 2003
Revised: February 20, 2003
Accepted: March 21, 2003
Published online: July 15, 2003

Abstract

AIM

Hepatitis B virus X protein (HBxAg) is a strong transactivator implicating in the transformation of normal hepatocyte and carcinogenesis. To understand the molecular mechanism of HBxAg in the up- and down-regulated genes of hepatocyte, we conducted microarray assay.

METHODS

The coding sequence of HBxAg was amplified by polymerase chain reaction (PCR) by using pCP10 containing the full length HBV genome DNA as the template. The expression of HBxAg in the transfected HepG2 cells was confirmed by Western blot methods. Total mRNA was isolated from the transfected HepG2 cells with pcDNA3.1(-) and pcDNA3-HBxAg, respectively. cDNA was prepared by reverse transcription. Microarray was conducted for screening of up- and down-regulated genes of both HepG2 cells.

RESULTS

The expressive vector of pcDNA3-HBxAg has been constructed and confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The expression of HBxAg has been confirmed by Western blot analysis. After screening with DNA microarray, we found 16 genes have been up-regulated, and 58 genes have been down-regulated.

CONCLUSION

The HBxAg is a very strong transactivator. Microarray is an important choice for the analysis of target genes of HBxAg transactivation.

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒, 长期的临床观察和广泛的流行病学调查结果表明, HBV感染与肝细胞癌(HCC, hepatocellular carcinoma)的发生、发展密切相关, 但是关于HBV感染引起HCC的机制, 虽然已经积累了大量的资料, 但是目前还没有定论[1-10]. HBV感染引起HCC的机制, 部分通过HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合, 造成肝细胞染色体的不稳定性, 甚至是染色体的异常转位, 整合位点病毒的基因启动子强制性地激活肝细胞生长的相关基因, 造成HBV感染肝细胞的过度生长[11-20]. HBV感染的肝细胞成为机体免疫系统识别与攻击的对象, 肝脏炎症的长期存在, 造成肝细胞坏死与再生持续存在, HBV的感染, 导致肝细胞对于环境中的致癌因素, 如黄曲霉毒素(aflatoxin)等作用的敏感性提高, 造成肝细胞的基因突变, 基因突变的不断积累, 在一定条件下发生HCC, 这一过程十分漫长, 这也与临床上长期受到HBV感染的患者, 很多年之后才发生HCC的现象是一致的[21-30]. 近年来, 随着分子生物学技术和理论的应用, 人们认识到HBV感染引起的HCC, 与HBV基因组编码的具有反式激活作用的病毒蛋白的反式激活作用有关[31-40]. 这种反式激活作用具有双重含义, 对于癌基因的激活, 以及对于抑癌基因的抑制. 近年来由于差异表达技术以及微矩阵(microarray)技术的应用, 对于各种肝炎病毒的结构和非结构蛋白反式激活的靶基因进行了筛选鉴定, 获得了大量有参考价值的资料, 但是还需要更为广泛深入的研究[41-50]. 我们应用基因表达谱芯片技术, 对于HBV的HBxAg表达反式调节的靶基因进行筛选鉴定, 试图寻找HBV感染时, HBxAg对于肝细胞基因表达谱的影响, 探索HCC发生的分子生物学机制.

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2细胞及感受态大肠杆菌JM109(本室保存), pcDNA3.1(-)真核表达载体(Invitrogen); Lipofectamine PLUS转染试剂(Gibco), mRNA Purification试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech), PCR-Select cDNA Subtraction试剂盒, 50×PCR Enzyme Mix、Advantage PCR Cloning试剂盒(Clontech), High Pure PCR Product Purification试剂盒(boehringer mannheim), T7、SP6通用引物及pGEM-Teasy载体(Promega).

1.2 方法

1.2.1 真核表达载体及细胞转染 HBV HBxAg蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-HBxAg为本室构建[25]. 用Lipofectamine PLUS 转染试剂将2 μg pcDNA3.1(-)-HBxAg及pcDNA3.1(-)空载体分别转染35 mm平皿HepG2 细胞, 48 h后收获细胞.

1.2.2 细胞mRNA提取 使用mRNA Purification试剂盒, 直接提取转染了HBxAg表达质粒及空载体的HepG2细胞mRNA, 经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计进行定性定量分析.

1.2.3 探针标记 参照Schena et al的方法逆转录标记cDNA探针并纯化. Cy3-dUTP标记对照组细胞mRNA(5 μg), Cy5-dUTP标记实验组细胞mRNA(5 μg). 乙醇沉淀后溶解在20 μl 5×SSC+0.2% SDS杂交液中.

1.2.4 芯片制备 包含的1152个cDNA由上海联合基因有限公司提供, 包括原癌基因和抑癌基因、免疫调节相关基因、细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因、信号转导相关基因等. 以通用引物进行PCR扩增, PCR产物长度为1 000-3 000 bp. 靶基因以0.5 μg/ μl溶解于3×SSC溶液中, 用Cartesian公司的Cartesian 7500点样仪及TeleChem公司的硅烷化玻片进行点样. 玻片经水合(2 h)、室温干燥(30 min), 紫外线(UV)交联, 再分别用0.2% SDS、水及0.2 g/L的硼氢化钠溶液处理10 min, 晾干备用.

1.2.5 杂交及洗涤 将基因芯片和杂交探针在95 °C水浴变性5 min, 将混合探针加在基因芯片上, 置于60 °C杂交15-17 h. 依次以2×SSC+ 0.2% SDS、0.1%×SSC +0.2% SDS、0.1%×SSC洗涤10 min, 室温晾干.

1.2.6 检测与分析 用General Scanning公司的ScanArray 3 000扫描芯片. 用预先选定的内参照基因(24条管家基因, 每个基因点2个点, 共48个点)对Cy3和Cy5的原始提取信号进行均衡和修正. 用ImaGene3.0软件分析Cy3、Cy5两种荧光信号的强度, 计算Cy5/Cy3比值. 阳性结果判断: Cy5/Cy3＞2.0, 红色荧光, 显示表达增强; Cy5/Cy3＜0.5, 为绿色荧光, 显示表达减弱.

2 结果

2.1 HBV HBxAg蛋白的表达载体构建

HBV HBxAg蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-HBxAg由本室构建[2].

2.2 总RNA及mRNA的定性、定量分析

总RNA的吸光度A260/A 280>1.89, 热稳定实验70 °C保温1 h与-20 °C 1 h电泳条带比较, 显示28 S条带无明显降解, 电泳结果证实已抽提高纯度的总RNA. mRNA主要集中于0.9-4.0 kb的连续条带.

2.3 HBV HBxAg蛋白上调基因类型(表1).

表1 HBV HBxAg蛋白上调基因类型.

编号	Cy3/Cy5比值	基因名称
1	2.047	组氨N-甲基转移酶(HNMT)
2	2.052	RET指状蛋白样蛋白1
3	2.071	蛋白激酶cAMP依赖性调节II型β(PRKAR2B)
3	2.079	钠通道VI型α多肽(SCN6A)
4	2.114	EGF受体(EGFR)
5	2.136	钾离子内流通道亚家族J成员3(KCNJ3)
6	2.141	IV型胶原α5(COL4A5)
7	2.181	p53结合蛋白MDM4
8	2.218	果蝇花生样蛋白2(PNUTL2)
9	2.232	细胞色素C氧化酶亚单位VIII(COX8)
10	2.329	FKBP相关蛋白(FAP48)
11	2.338	丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶3(MAP4K3)
12	2.471	鸟苷酸环化酶1β3(GUCY1B3)
13	2.591	促胸腺生成素(TMPO)
14	2.741	肌管蛋白相关蛋白6
15	2.888	推定蛋白FLJ11806
16	3.290	S100钙结合蛋白A11(S100A11)

见表1.

2.4 HBV HBxAg蛋白下调基因

在基因芯片的扫描分析中, 如果荧光染料的Cy5/Cy3比值在0.500以下, 就判断为HCV NS3蛋白得下调基因. 在本研究中发现有34种基因的表达水平下调(表2).

表2 HBV HBxAg蛋白下调基因类型.

编号	Cy3/Cy5比值	基因名称
1	0.201	硫氧还蛋白还原酶(TXNRD1)
2	0.245	酵母RAD23基因同源基因A(RAD23A)
3	0.250	酵母线粒体内膜转位酶17同源基因B(TIM17B)
3	0.259	TNF受体超家族成员5(TNFRSF5)
4	0.262	蛋白磷酸酶2Aα型(PPP2R1A)
5	0.273	prosaposin(PSAP)
6	0.286	S-腺苷同型半胱氨酸羟化酶(AHCY)
7	0.288	脚手架黏附因子B(SAFB)
8	0.297	细胞色素P450超家族XXVIIA(CYP27A1)
9	0.300	MGC15351
10	0.303	死亡相关蛋白3(DAD3)
11	0.305	推定蛋白FLJ20500
12	0.314	细胞膜糖蛋白(GP110)
13	0.319	热休克蛋白70A1(HSP1A1)
14	0.323	金属蛋白酶1(MP1)
15	0.327	组织蛋白酶D(CTSD)
16	0.327	RNA多聚酶II多肽E(POLR2E)
17	0.341	4-氨基丁酸氨基转移酶(ABAT)
18	0.350	推定肌管蛋白相关蛋白8(MTMR8)
19	0.357	肌动蛋白结合LIM蛋白1(ABLIM)
20	0.360	支链酮酸脱氢酶E1(BCKDHA)
21	0.360	二肽酶1(DPEP1)
22	0.368	肿瘤蛋白D52样蛋白2(TPD52L2)
23	0.372	推定蛋白KIAA0123
24	0.375	前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 7(PCSK7)
25	0.387	缬氨酰-tRNA合成酶2(VARS2)
26	0.395	未知基因23856
27	0.396	酵母hnRNP甲基转移酶样蛋白2(HRMT1L2)
28	0.401	胸腺嘧啶激酶1(TK1)
29	0.414	谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)
30	0.414	肌型丙酮酸激酶(PKM2)
31	0.424	苯丙氨酸t-RNA合成酶样蛋白(FARSL)
32	0.426	Transgelin 2蛋白(TAGLN2)
33	0.430	干扰素诱导蛋白35
34	0.436	未知基因序列zj99f11.r1
35	0.438	CGI-69蛋白(LOC51629)
36	0.439	蛋白磷酸酶1, α型催化亚单位(PPP1CA)
37	0.447	肌醇1, 3, 4三磷酸5/6激酶(ITPK1)
38	0.447	组织特异性移植抗原P35B(TSTA3)
39	0.447	热休克蛋白75(TRAP1)
40	0.450	NADH脱氢酶
41	0.450	ras同源基因家族C(ARHC)
42	0.452	核孔蛋白153 kD(NUP153)
43	0.459	4跨膜位点亚家族A1(MS4A1)
44	0.461	真核翻译起始因子3亚单位8(EIF3S8)
45	0.463	组织蛋白酶E(CTSE)
46	0.465	磷酸甘露糖突变酶1(PMM1)
47	0.465	微管蛋白β2(TUBB2)
48	0.467	黑色素瘤抗原家族D1(MAGED1)
49	0.470	颗粒蛋白(GRN)
50	0.474	calpain小亚单位1(CAPNS1)
51	0.475	推定蛋白FLJ21819
52	0.478	黑色素瘤抗原家族D12(MAGED2)
53	0.483	氯离子通道蛋白6(CLCN6)
54	0.484	类固醇生成的急性调节蛋白相关蛋白(MLN64)
55	0.485	烯醇化酶3(ENO3)
56	0.496	真核翻译延伸因子2(EEF2)
57	0.497	小细胞核核糖体蛋白多肽A(SNRPA)
58	0.497	TGF β受体1(TGFBR1)

3 讨论

早期研究发现, 整合的病毒DNA编码的HBxAg是一种重要的转录激活因子, 对乙型肝炎的慢性化和促进肝细胞的恶性转化有密切关系. 研究HBxAg功能的方法大多数采用瞬时表达系统, 将含有X基因的表达载体与报告基因载体用共转染的方式来研究. HBxAg的功能状态与其细胞定位有关, 核内HBxAg可通过与DNA结合蛋白作用, 激活转录因子或基本转录过程, 通过反式激活转录元件而促进病毒的复制[51-60]. HBxAg还能在DNA水平激活转录. 已有报道HBxAg可以与多种转录激活因子发生相互作用, 这些因子包括Oct1、ATF、ATF2、CREB3、Egr1、p53、IL-6及含有bZip区的一些因子． 而胞质中的HBxAg则主要通过刺激信号转导途径而引起一系列的反应, 激活AP-1、NF-kB等一批转录因子, 干扰细胞内信号转导通路反式激活转录, 导致细胞的转录、增生[61-70]．

HBxAg功能域的分析, 研究认为, N末端和C末端对其反式激活都不重要, 转录活性区位于32-148 aa内: 其中32-66区可能为结合功能域, 而105-148区富含负电荷, 是其他反式激活因子的典型激活功能域所具有的特征. Arii et al认为有3个关键功能域: 第46-52 aa(尤其是Pro-46、His-49、His-52), 第61-69 aa(尤其是Cys-61、Gly-67、Pro-68、Cys-69), 第132-139 aa(尤其是Phe-132、Cys-137、His-139), 这三段序列在不同的嗜肝病毒中高度保守, 第一段序列形成组氨酸/天冬氨酸功能样特征, 第二与第三段序列与Kunitz样丝氨酸蛋白酶抑制剂的Kunitz功能区高度同源．N末端5-27 aa或C末端143-154 aa缺失, 对HBxAg活性没有影响[71-80]. HBxAg基因序列是高度保守的, 我们在以HBxAg基因序列为靶区域, 研究HBV在慢性感染患者体内的存在状态时发现, HBxAg基因具有准种特点, 在其羧基末端存在相对的高变区. 进一步研究发现HBxAg基因的异质性和准种特点对于其反式激活作用具有显著的影响[81-84]. 这些研究结果的差异, 可能是HBxAg在不同细胞通过不同因子或途径起作用而导致所需的功能域不同所致．

研究发现HBxAg的反式激活作用呈现明显的广谱性, 能够反式激活多种同源或异源的病毒或细胞转录调节基因区, 包括HBV增强子/核心启动子、S基因启动子, SV40的增强子及早期启动子, 单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子(HSV-TK), 人T淋巴细胞I型病毒(HTLV-1)的长末端重复序列(LTR)、人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)、劳氏肉瘤病毒(RSV)及β-干扰素等的启动子. HBxAg也可反式激活聚合酶(pol)I、II、III启动子, 并且对c-myc、HLA-DR、MHC-I及IL-8等都有反式激活作用．

我们以含有全长乙型肝炎病毒基因的pCP10质粒作为模板, 应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的HBxAg基因片段, 常规分子生物学技术构建HBxAg的真核表达载体pcDNA3-HBxAg, 利用脂质体转染技术转染HepG2细胞, HBxAg蛋白的表达以 Western blot杂交技术证实. 从转染和非转染细胞HepG2种提取总mRNA, 逆转录为cDNA, 并进行基因芯片技术分析. 结果表明, 16种基因的表达水平上调, 58种基因的表达水平下调. 这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导等基因, 相信这些类型的基因在HBxAg的恶性转化中具有十分重要的作用.

Wu et al [85]应用NCI建立的含有2 208基因点的Oncochip microarray系统, 对于新鲜分离的人肝细胞与表达HBxAg的人HCC细胞系SK-Hep-1的基因表达谱进行了比较分析. 基因芯片的研究结果又通过Northern blot杂交分子进行证实. 发生变化的基因类型包括一些癌基因如c-myc、c-myb, 肿瘤抑制基因如APC、p53、WAF1、WT1等. 进一步证实了HBxAg的恶性转化作用机制主要是通过对于癌基因和肿瘤抑制基因的异常调节而实现的.

Han et al[86]对于稳定表达HBxAg的HepG2(HepG2-HBx)的基因表达谱进行分析, 在588个靶基因中, 2种癌基因IGFR-2、RhoA和1种细胞周期调节基因p55CDC, 以及3种信号转导基因如凝血酶受体(thrombin receptor)、MLK-3、MacMARCKS, 1种应急应答基因HSP27, 2种细胞调亡调节基因FAST激酶、Bak, 1种转录因子p21/WAF基因的表达水平显著上调. 1种转录因子即转录延长因子SII(transcription elongation factor SII), 2种生长因子如单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1)、T淋巴细胞分泌蛋白 I-309(T-lymphocyte-secreted protein I-309)显著下调. 这些研究结果表明, HBxAg对于肝细胞的基因表达谱有显著的影响, 基因芯片技术是研究基因表达谱改变的有效分析技术[87-98].

备注

$[Footnotes]

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