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世界华人消化杂志. 2003-07-15; 11(7): 1011-1014
在线出版日期: 2003-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i7.1011
丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活作用的研究
杨艳杰, 成军, 陈东风, 钟彦伟, 张忠东, 李强
杨艳杰, 成军, 钟彦伟, 张忠东, 李强, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室北京市 100039
陈东风, 中国人民解放军第三军医大学大坪医院消化内科重庆市 400038
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetheray.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-01-11
修回日期: 2003-01-20
接受日期: 2003-02-16
在线出版日期: 2003-07-15

N/A

关键词: N/A
引文著录: 杨艳杰, 成军, 陈东风, 钟彦伟, 张忠东, 李强. 丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活作用的研究. 世界华人消化杂志 2003; 11(7): 1011-1014
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: January 11, 2003
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 16, 2003
Published online: July 15, 2003

N/A

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)是1989年应用分子生物学技术克隆成功的一个RNA病毒, 属黄病毒科, 可引起慢性肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌, 目前有1.7亿人感染, 干扰素联合利巴韦林是其治疗方案, 但是疗效不佳[1-9]. 目前世界各国都在积极研究其发病机制, 探索新的治疗措施. 但由于HCV的宿主范围较窄, 只能在人及黑猩猩中繁殖, 为研究带来一定困难. HCV是怎样与宿主细胞相互作用的, 世界上进行了广泛的研究. 现在一致认为病毒进入到肝细胞后, 肝炎病毒蛋白在肝细胞内不是孤立存在, 病毒基因组在肝细胞内有两种调节方式; 其一是顺式调节, 如启动子及增强子序列, 以直接方式影响另外一些基因组的功能, 是基因组内部调节方式; 其二是反式调节, 即基因组中一部分基因片段通过其转录或翻译产物产生对另一部分基因片段表达的调节方式, 如病毒基因组表达的反式激活蛋白, 以表达产物的间接方式参与另外一些基因功能调节, 可以对基因组内部的基因, 甚至对其他细胞或病毒的基因组有调控作用. 这种病毒蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用, 影响了肝细胞的基因表达谱, 是病毒感染慢性化以及引起感染的肝细胞发生恶性转化的分子生物学机制之一[6-8]. 特别是HCV各蛋白组分(C、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b)与人体蛋白之间的相互作用, 为HCV所致疾病的发病机制提供了线索.

1 丙型肝炎病毒基因组基本结构

HCV基因组是一单股正链RNA, 全长大约由9400核苷酸(nucleotide, nt)组成, 含有一个大的开放读码框架(open reading frame, ORF), ORF几乎跨越HCV基因组, 可编码一大约3010个氨基酸残基(aa)的病毒前体蛋白(precursor polyprotein). HCV基因组5'-末端为非编码区(untranslating region, 5'-UTR), 位于ORF的上游, 含有3～4个小的ORF. HCV基因组的3'-末端为3'非编码区(3'-UTR), 位于ORF的下游, 可含有多聚(A)或多聚(U)尾. 5'-UTR和3'-UTR在病毒的复制和稳定病毒的生物学形状等方面起重要作用. 根据所编码蛋白的结构和功能, 可将基因组分为结构基因(structural gene)和非结构基因(nonstructural gene). 结构基因分为核心区(core region)和包膜基因(envelope gene), 分别编码病毒的核心蛋白和包膜蛋白, 这些蛋白参与病毒颗粒的组装, 故又称结构蛋白. 非结构(NS)基因包括NS2、NS3、NS4和NS5基因, 分别编码NS2-5等4种蛋白, 这些蛋白不构成病毒颗粒的结构成分, 主要与病毒的复制有关, 如作为信号酶、螺旋酶和RNA聚合酶等, 故又称为非结构蛋白或功能蛋白. 不同国家和地区分离的HCV株其基因结构有一定的差别. HCV基因组结构与人类黄病毒属和动物瘟病毒属中某些病毒如日本脑炎病毒、登革热病毒和牛腹泻病毒等基因组有许多共同特征, 这些共同特征对于了解HCV分子生物学特性很有帮助. 这些共同特征包括: (1)病毒基因组长度相似, 复制时都先编码一个大的病毒前体蛋白, 然后在病毒和宿主的蛋白酶的作用下分解成单一病毒蛋白; (2)NS3和NS5蛋白中某些部位氨基酸序列有高度同源性. 如第1230-1500位有能与NTP结合的螺旋酶残基, 第2703-2739位含Gly-Asp-Asp基元, 这在病毒编码RNA依赖的RNA聚合酶方面具有高度保守性; (3)病毒蛋白的疏水性相似, 由此可以研究病毒蛋白的抗原性及其可能在宿主细胞内的存在部位.

2 HCV核心蛋白结构及其对基因的调节作用

HCV核心区基因位于HCV基因组1-573 nt位点, 编码核衣壳蛋白(又称之为核心蛋白或C蛋白). C蛋白由191个氨基酸残基组成, 分子量为21 kD, 其中含有许多脯氨酸、精氨酸和赖氨酸残基, 因而表现为嗜碱性. 完整的重组C蛋白称p22, 本身缺乏N-糖基化位点, 其C端20个氨基酸具有高度疏水性, 可能是作为信号序列(signal sequence). p22在参与病毒组装前, 需要进一步加工和修饰, 能较好地保证检测感染者血清中相应的抗体.

近年来研究发现, C蛋白具有对多种基因的调控作用. HCV和HBV重叠感染的一个重要特征是出现病毒干扰现象, 即导致乙型肝炎病毒(HBV)病毒血清标志物的消失或病毒复制水平的下降. 为探讨这一现象的发生机制, 有研究者构建了全长和部分长度的HCV结构区(C、E1和E2/NS1)基因表达载体, 然后与HBV表达载体共转染人肝癌细胞系HuH-7细胞. 结果发现, HBsAg和HBeAg表达量均明显减少, 释放入培养细胞上清液的病毒颗粒也明显减少. 如果用完整的或编码N端122 aa的C区基因替代上述HCV结构区, 可以得到类似的结果, 表明HCV C基因及其表达与HBV基因组的复制和表达明显相关. 提取细胞核中的RNA所做的Northern印迹实验显示, HBV前基因组RNA的产生也同时减少, 提示这种抑制作用可能发生在转录水平以及前基因组RNA衣壳化(encapsidation), 其进入胞核内的时间(第6天)恰好与HBV出现复制和表达减少的时间相吻合, 因而得出结论, 上述抑制作用是由HCV C基因的表达产物-C蛋白所致, C蛋白可能是一种基因调节蛋白的说法也由此而生.

C蛋白的磷酸化-去磷酸化是实现对HBV复制抑制的重要条件. 对C蛋白的磷酸化过程进行了研究发现, 其磷酸化是由蛋白激酶A和蛋白激酶C催化完成, 磷酸化位点位于C蛋白99位和116位aa, 如果采用点突变方法, 将这两个丝氨酸换成丙氨酸, 丧失了对HBV的抑制作用, 说明C蛋白对HBV的抑制受磷酸激酶A和磷酸激酶C的控制. C蛋白对HBV复制的抑制作用的确切机制尚不清楚. 有研究观察到C蛋白能够结合HBV复制中间体, 因而推测可能通过影响HBV的翻译和装配实现抑制HBV复制效应.

此外研究发现, C蛋白具有多种调控细胞、病毒基因表达、细胞生长以及免疫调节等功能, 对细胞信号转导途径, 尤其是NF-κB(nuclear factor-κ-gene binding)即κ基因结合核因子、激活蛋白1 (activator protein-1, AP-1)和血清效应元件 (serum reponse element, SRE)相关途径具有明显的增强作用, 影响相关的靶基, 如c-myc、c-fos、c-jun等基因, 劳氏肉瘤病毒长末端序列(long terminal repeat, LTR)、猴空泡病毒40早期启动子和p53基因启动子的功能[10,11]. Giambartolomei et al [12]认为, 感染HCV的肝细胞发生肿瘤的机制是由于在稳定表达Ｃ蛋白的细胞系中干扰了肝细胞的正常信号转导过程. Lee et al[13]研究证实HCV核心在胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor Ⅱ, IGF-Ⅱ)的转录过程中充当着反式激活子的作用. HCV核心蛋白通过Sp1和Egr1这2个顺式作用元件作用于IGF-Ⅱ的启动子4(P4)使内源性的IGF-Ⅱ表达增强, 因 Sp1和Egr1均可以结合到IGF-ⅡP4上并能最大限度的调节其活性. 而且, HCV核心刺激SP1和Egr1磷酸化, 并通过HCV核心的转染上调SP1和Egr1结合DNA的活性. 用HCV核心转染HepG2细胞可刺激蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)膜异位, 用钙磷酸蛋白C(calphostin C, PKC抑制剂)处理HCV核心转染的细胞, 可阻止SP1和Egr1诱导的DNA结合活性, 最终阻止IGF-Ⅱ基因的反式激活转录在肝细胞癌发生过程中, 增强的SP1和Egr1磷酸化形式的DNA结合活性对于调节IGF-Ⅱ基因表达和促进细胞分化或许是一个很重要的机制. 这个研究结果表明, HCV核心蛋白通过PKC信号传导通路在IGF-Ⅱ的转录中作为一个正调节因子, 而且SP1和Egr1是其在IGF-Ⅱ转录调节过程的直接靶位, 这些对于HCV所致肝细胞癌的致病机制起着非常重要作用.

3 HCV核心蛋白对蛋白的反式调节作用

HCV核心蛋白与人体作用复杂, 有反式激活细胞基因表达的作用. 表达HCV核心蛋白的肝肿瘤细胞可以引起细胞脂肪变性, 转基因小鼠出现肿瘤, 因此HCV核心蛋白在肝脏疾病中起重要作用. 为了弄清其作用机制, 进行了很多研究, 其中蛋白之间的相互作用研究比较广泛.

HCV核心蛋白与淋巴毒素β受体胞质尾部相互作用, Matsumoto和Chen et al[14,15]用酵母双杂交技术对人肝cDNA文库进行筛选, 一半以上的克隆都是淋巴毒素β受体(LT-βR)胞质域, 是肿瘤坏死因子受体家族的一个成员. 他们的结合被谷胱甘肽S转移酶(GST)融和蛋白结合实验和蛋白印迹分析所证实. 结合定位在这个受体的胞质尾部的58 aa区, 在核心蛋白上定位在36-91 aa(蛋白亲水区). 在哺乳动物细胞中核心蛋白与膜LT-βR结合. 因为这个受体生发中心的形成以及外周淋巴样器官的发育调节, 淋巴结发育凋亡信号, HCV核心蛋白与LT-βR结合, 表明这个蛋白可能有免疫调节功能, 可能解释病毒持续感染和发病机制. Owsianka et al[18]进一步证实HCV核心蛋白可与LT-βR结合, 在一些细胞中, 通过此通路核心蛋白起到调节作用. LT-βR/ LT-α1, β2受体-配体相互作用的已知作用是外周淋巴样器官和触发细胞裂解活性以及NF-κB活性, 他们的发现提示HCV核心蛋白增强LT-βR生物功能, 引起HCV感染细胞的发病.

核心蛋白与异源核糖核蛋白K (hnRNP K)结合. Hsieh et al [16]鉴定出hnRNP K可以与核心蛋白相互作用, 这个蛋白证实是转录因子. 这两个蛋白可以部分共定位在核内. 核心蛋白结合hnRNP K的位置在25-91 aa区, 是氨基端的亲水区. hnRNP K的核心蛋白结合域定位在250-392 aa, 含有3个脯氨酸丰富区. 再者, HCV核心蛋白可以释放hnRNP K对胸腺嘧啶激酶基因启动子的抑制活性. 这两个蛋白的特异性结合可能破坏了hnRNP K多重功能, 部分地解释了HCV发病机制.

HCV核心蛋白与细胞推定的RNA解旋酶相互作用, You et al[17]为了了解HCV核心蛋白的反式激活机制, 克隆了一个cDNA编码的DEAD盒家族中推定的RNA解旋酶称为CAP-Rf, 与别的RNA解旋酶(如DBX和DBY鼠mDEAD3和PL10, 这个家族的蛋白一般涉及翻译、剪切, 发育和细胞生长)具有95 %同源性. HCV核心蛋白的全长成熟形式和C末端截短形式均可以和这个蛋白结合.HCV结合区域定位在氨基端的40 aa区及CAP-Rf的C末端, 这个区域包括RNA结合和ATP水解功能. 免疫印迹或免疫荧光分析表明内源性CAP-Rf主要定位在核中, 在细胞质中较少; 与FLAG标签融合后与HCV核心蛋白既在核内又在胞质中共定位. 与别的RNA解旋酶相似, 这个细胞RNA解旋酶具有核苷三磷酸酶-脱氧核苷三磷酸酶活性, 但这个活性可以被各种形式的同源多聚核苷所抑制, 被核心蛋白所加强. 再者在人肝肿瘤细胞系Huh-7中瞬时表达HCV核心蛋白增强了CAP-Rf反式激活活性. 总的来说CAP-Rf所涉及基因表达的调节及HCV核心蛋白启动CAP-Rf反式激活能力可能是通过复合体形式和CAP-Rf ATPase活性调节, 这些发现表明HCV已经进化了一种特殊机制, 通过其核壳蛋白涉及RNA代谢, 这个特征说明了核心蛋白对宿主细胞的多重作用.

HCV核心蛋白与人DEAD盒蛋白DDX3相互作用, Owsianka et al[18]用酵母双杂交克隆了推定的RNA解旋酶C末端253 aa, DEAD盒蛋白命名为DDX3. 细菌表达GST-DDX3融合蛋白能特异地拉住体外翻译的放射标记的HCV核心蛋白. 用多克隆抗血清免疫荧光染色HeLa细胞显示DDX3融合蛋白主要位于核壳而胞质中较少. 用表达HCV的结构蛋白(core, E1, E2)的痘苗病毒感染细胞后DDX3和核心蛋白共定位在细胞质的核周区的特定区域. 结合区在核心蛋白的C末端RS样域. 人DDX3是推定的RNA解旋酶, 是一种高度保守的DEAD盒亚族-包括鼠PL10排列, 非洲爪蟾的An3和酵母的Ded1的一个成员. 他们在RNA代谢或基因表达中的作用是未知的.

Mamiya et al [19]同样证明了HCV核心蛋白与DEAD盒的一RNA解旋酶结合. 用同样的方法分离到DEAD盒蛋白DBX. DBX和鼠PL10(ATP依赖的RNA解旋酶)的氨基酸序列高度一致. 体外实验也证明了他们的相互作用. 哺乳动物细胞表达发现HCV核心蛋白和DBX被共同定位在内浆网. 酿酒酵母突变株中DBX可以互补Ded1p(主要的DEAD盒RNA解旋酶功能)的功能. HCV核心蛋白可以抑制DBX补充的突变酵母生长, 但是不会抑制Ded1表达的酵母生长. HCV核心蛋白也抑制带帽的但不抑制不带帽的RNA的体外翻译. 结果表明了核心蛋白和这个宿主细胞蛋白相互作用涉及RNA代谢, 所以HCV可能抑制mRNA翻译机制.

Sabile et al[20]发现HCV核心蛋白可以调节细胞的脂肪代谢, 用酵母双杂交的方法发现病毒的核心蛋白可以和载脂蛋白AⅡ结合. 结合域在核心蛋白C末端. 又在建立好的细胞模型-氯贝特引起HepG2细胞apoAⅡ表达的升高. 在用降脂药物非诺贝酸(fenofibric acid)处理后, 发现apoAⅡ和核心蛋白的分泌平行升高. 这个效应可用贝布雷非德菌素A(brefeldin A)所消除, 表明非诺贝酸干预细胞脂代谢后直接影响HCV核心蛋白的表达型. HCV核心蛋白与14-3-3蛋白相互作用激活激酶Raf-1. Aoki et al [21]鉴定了14-3-3蛋白家族的一个成员与HCV核心蛋白相互作用, 14-3-3蛋白以磷酸丝氨酸依赖方式结合HCV核心蛋白. 导入HCV核心蛋白可以使得HepG2中和酵母遗传分析中的Raf-1激酶活性明显. 结果表明了HCV核心蛋白通过和14-3-3蛋白相互作用表现出一种新型的Raf-1激酶激活蛋白特性, 可能对肝细胞的生长起调节作用.

Cho et al[22]报告, C蛋白可通过上调细胞周期蛋白E而促进细胞增生. 用C蛋白转染Rat-1细胞系后, 其pRb水平下降, 而E2F-1上调, 细胞的增长率升高, 并对凋亡敏感[23]. 补体受体gC1qR和HCV 核心蛋白相互作用抑制T-淋巴细胞增生. Kittlesen et al [24]采用酵母双杂交方法用核心蛋白筛选人T细胞文库鉴定出编码gC1q受体基因(gC1qR). C1q是gC1qR的配体涉及宿主的早期感染防御. 与C1q一样, HCV核心能够抑制T细胞增生应答. 在T细胞增生分析中这个核心诱导的抗T细胞增生可以被加入抗gC1qR Ab扭转. 进一步生化分析核心蛋白和gC1qR相互作用指出HCV核心蛋白结合到gC1qR的188-259 aa区, 这个位置与结合C1q的区域不同. HCV核心蛋白可以抑制T细胞应答可能对于HCV在人类中持续感染有重要意义[25].

国内有人[26]通过共转染实验证实HCV核心蛋白与截短型的HBV表面抗原中蛋白具有协同的反式激活作用. 临床上部分患者有HBV和HCV的重叠感染, 这两种病毒蛋白可同时表达于肝细胞中, 因此可能与两种肝炎病毒重叠感染的不同临床特征有一定关系. 国内也有研究者[27]发现HCV核心蛋白还可以和一些未知功能的基因的相互作用值得进一步研究.

总之, HCV基因组编码的核心蛋白除了与HCV RNA结合, 保护HCV RNA免受RNA酶的消化作用, 维持HCV RNA的稳定性外, 还具有一系列不同的生物学调节作用[25,27,28]. HCV核心蛋白作为一种反式激活蛋白, 对于感染的肝细胞中基因表达谱产生影响, 同时, HCV核心蛋白自身结合形成同二聚体结构, 也可以与肝细胞中其他类型的蛋白之间进行结合, 形成异二聚体或多聚体结构, 对于肝细胞中的信号转导产生严重干扰. 通过这些生物学作用, 对于肝细胞的凋亡、细胞周期进行调节, 从而参与HCV感染的发病机制[29]. HCV感染除了引起急性和慢性病毒性肝炎、肝细胞癌、肝纤维化、还包括肝脏脂肪变、B细胞淋巴瘤、冷球蛋白血症等, 这些病理改变的分子生物学机制, 目前我们还知之甚少, 需要进行细致深入的探索, 以阐明HCV感染与这些病理改变之间的相互关系[30].

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