乙型肝炎病毒核心启动子的结构及调节研究

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Correspondence to: N/A

Received: January 11, 2003
Revised: January 20, 2003
Accepted: February 16, 2003
Published online: July 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的疾病, 呈全球性分布, 目前全世界有3.5亿人感染乙型肝炎病毒(HBV), 其中相当一部分感染者发展为慢性肝炎, 少数还发展为肝硬化甚至肝癌, 至今仍缺乏有效控制[1-5]. 造成这一局面的原因很多, 其中关于HBV与肝细胞之间相互作用的分子生物学机制的研究进展相对滞后是严重影响新型治疗技术和新型药物开发与研究的重要原因之一. 进一步弄清HBV DNA的复制、转录及调节的过程, 对于我们研究乙型肝炎的发病机制具有重要意义. 本文仅就乙型肝炎病毒核心启动子(CP)结构及调节近几年的研究进展作一综述.

1 乙型肝炎病毒基因组结构

HBV是很小的包膜病毒. HBV DNA和HBV聚合酶由核壳包裹成为核心颗粒, 再由含HBsAg的脂蛋白包裹. 病毒基因组是3.2 kb的部分双链DNA. 双链的长度不等, 负链与病毒的mRNA互补, 较短的链为正链. HBV基因组结构精密, 仅约3200 bp(3 182-3 221 nt, 3.2 kb), 但可以最小容量发挥高效功能. HBV负链核苷酸序列至少有4个开放读框(open reading frame, ORF): C、P和S基因(相当于逆转录病毒的gag、pol和env基因)分别编码核壳、聚合酶和外膜蛋白; 另一ORF因开始鉴定时对其基因产物的功能不明而称X. 正链序列上似无保守序列, 由双链DNA转录为RNA, 是一个需要高度调节的过程. 因而病毒基因组不仅含有编码蛋白的结构基因, 也有调节元件. 作为调节元件的一段DNA序列, 可与某些细胞蛋白或病毒蛋白结合, 正性或负性调节转录. 分散在整个HBV基因组中有多个调节元件(regulatory element), 包括４种启动子、２种增强子、包装信号ε、糖皮质激素应答元件等[6].

2 乙肝核心启动子(CP)的结构及调节

CP在1591和1822nt(从EcoRⅠ位点), 包括至少232 bp[7], 结构及功能都十分复杂. 与增强子Ⅱ部分重叠的1687 nt(HincⅡ)下游核苷酸序列对于启动子的活性是非常必要的. CP与X基因的3'末端(1 837-nt)、C基因前-C区的5'末端(1 814 nt)重叠; 增强子Ⅱ(1687-1775 nt)和顺向重复序列(DR, direct repeat, 1826-1836 nt)完全在CP区域内; 前基因组mRNA(1785- nt)和前基因组-C/P mRNA(1820- nt)都由此处开始. HBV的C基因调节序列区(C基因前-C区上游约200 bp)包括多个元件, 有直接重复序列DR1/DR2、负链缺口、增强子Ⅱ和C基因启动子(CP).

CP区在1643-1849 nt, 结构和功能较复杂. CP与X基因远端和C基因的前-C区有部分重叠; DRⅠ和增强子Ⅱ在其区域内. CP由核心上游调节序列(CURS)和基本启动子(BCP)两部分构成, 前者是后者的强激发者. CURS中含2个重复序列(1668-1684 nt), 是肝细胞核因子的结合部位. 在CP上游还有一个顺式抑制元件(cis-acting repressing element, NRe), 负调节CP活性. BCP在1742-1849 nt区段, 包含DRⅠ区、前-C和C基因的2种mRNA的起点; BCP区段中有4个TATA盒样序列(TA), 其对于前C mRNA和前基因组RNA在体内的精确转录的起始是很重要的.

CP调节3.5 kb mRNA的合成, 编码HBeAg前体和前基因组C/P蛋白, C基因附近区段是HBV复制的关键性部位, 有多种调节序列. CP和增强子Ⅱ调节核壳蛋白的合成. CP与HBV的肝细胞特异表达有关, 如以一种在大多数细胞中都有功能的金属硫蛋白(metallo thionein)启动子代替CP, HBV DNA即可在一种人的非肝细胞系HeLa细胞中表达. Lopez-Cabrera et al[7]指出从老鼠肝细胞核提取物纯化的CCAAT/增强子结合蛋白(C/enhancer binding protein, C/EBP), 是一个肝脏特异性的核因子, 在CP上至少结合了5个位点, 而其中的3个位点与增强子Ⅱ重叠. C/EBP在一定程度上激活了CP低浓度的表达, 但在高浓度反而抑制其表达. 肝细胞核因子1(hepatocyte nuclear factor Ⅰ, HNF 1)具有肝特异性, 能够激活许多肝特异性基因的转录活性. Wang et al[8]研究了HNF 1对增强子Ⅱ的影响, 他们指出HNF1可以激活HeLa细胞中增强子Ⅱ的活性而这个细胞并不表达HNF1, 并且抗检测的HNF1抑制其在HepG2细胞中的表达. 已鉴定1718-1736 nt区域是HNF1活性的靶位点. 这个区域与HNF3结合位点重叠, HNF3是另一个通过增强子Ⅱ调节CP活性的肝富集因子[9]. HNF4在增强子Ⅰ/X基因启动子区有1个结合位点, 另2个结合位点则位于CP区内[10]. 尽管HNF4与前面位点结合, 但其对病毒的转录无明显影响, 而另外两个位于BCP的位点都独立介导HNF4依赖的转录活性[11].

3 C基因启动子的突变及其生物学意义

乙肝的X基因在1643-1850 nt, 增强子Ⅱ在1627-1774 nt大部分重叠. 这一区段是病毒复制的重要调节区, 是转录、反转录和正链合成的起点, 也是多种细胞因子的结合部位. 这一区段的变异较易对病毒转录、复制等生物学特性产生影响.

CP区变异并非独立的突变位点, 常是多位点变异的组合. BCP上的双变异1762 nt的A2→T和nt1764的G→A在慢性HBV感染中较常见, 在肝衰竭的患者1638 nt T→C、1673 nt C→T、1727 nt A→T、1730 nt C→G变异出现的也较多. 变异涉及前-C mRNA(1790±1 nt)起始位点上游28 bp AT富集区的TTAAA序列(1758-1762 nt), 而前基因组RNA起始位点(1818 nt)上游23 bp的ATAAATT序列(1789-1795 nt)仍然完整. 用于前-C和前基因组RNA合成的启动子元件不同, 是分开调节的. BCP控制前-C和C RNA的转录.前-C RNA编码分泌的HBeAg; 而C RNA编码核心蛋白、DNAp和前基因组RNA. 变异株合成HBeAg的水平降低, 合成HBcAg无影响, 而病毒复制反可增强, 核心颗粒也比野毒株多2-4倍[12]. Kidd-Ljunggren et al[13]从不同基因型的59株HBV和不同HBeAg/抗HBe状态的患者分析, 前-Ｃ和前基因组RNA的起始密码和TATA元件高度保守, CP区的绝大多数缺失会导致转译读框迁移和终止, 截短Ｘ蛋白的Ｃ末端. CP中1762-1764 nt变异抑制HBeAg产生而病毒产生增强. 1762 nt及/或1764 nt变异常伴随1751-1755 nt的点突变. 对HBeAg表达的抑制作用: Buckwold et al[14]研究发现肝内富集的转录因子可结合于DNA覆盖1762 nt和1764 nt, 变异的BCP可能改变这种结合, 降低前-C RNA的转录, 最终使HBeAg平均降低70%. 这一双变异抑制, 并不终止HBeAg的表现型. 前-C基因表达减少但不影响前基因组RNA的合成. 增强前基因组RNA的包装, 子代病毒产生增加. Gunther et al[15]发现, HBV 1762 nt和1764 nt变异株与活动性肝炎、移植后的严重肝病、肝细胞癌相关, 联合1653 nt变异、与急性暴发性过程相关. 这些变异降低前-C mRNA水平(低55%)和HBeAg分泌, 但对前基因组/C和前-S/S mRNA、细胞内核心、聚合酶和前-S/S2蛋白和S抗原分泌无显著影响.在细胞内和培养液中的子代病毒DNA量稍增加. 对病毒复制的调节作用: 一方面, HBV/CP的转录活性可被炎症因子调节. 肿瘤坏死因子TNFα、IFNγ和IFNα都可降低病毒的转录活性40%. Romero et al[16]证实HBV DNA含有与转录蛋白相一致的元件, 其结合活性可由炎症细胞因子调节. TNFα、IFNγ和IFNα各降低报告构件虫萤光素酶活性40%, TNFα和IFNγ合用抑制程度倍增. 为维持TNFα效应必须保留C/P转录开始部位上游330 bp, 以TNFα处理转染HBV DNA的HepG2细胞, 在细胞内核心颗粒中的复制型HBV降低60%. 这些细胞因子的抑制作用, 提示一种非细胞溶解机制在感染肝细胞中由抗原非特异免疫应答部分调节HBV的复制. 另一方面, BCP变异导致高水平复制, 这一变异株显示为前基因组RNA增强的表现型. HBV复制只能在核心颗粒内, 是在前基因组RNA、HBcAg和DNAp之间相互作用而装配成的. BCP变异使前基因组RNA转录仅稍有增强(2-3倍), 而病毒包装则有很大增强(>10倍), BCP变异因包装功能增强而提高复制水平. Baumert et al[17]曾在暴发性肝炎相关的一株HBV的核心启动子中鉴定出2处变异(1 768 nt C变T和1 770 nt T变A), 因前基因组RNA进核心颗粒的病毒包装增加使复制提高. 这两处变异增加核心蛋白合成15倍, 从而增加病毒包装; 而前基因组 RNA的转录只增加2倍, 反转录的聚合酶也只增加2倍, 复制增强也只在核心蛋白增加时.这些结果提示HBV/CP在转录和转录后水平调节核心蛋白表达.

另一解释是CP区变异产生了肝细胞核因子(HNF-1)的结合位点, 因这一转录因子的介导, 使前-C mRNA水平下降, 从而使HBeAg减少; 而C mRNA和前基因组RNA水平则增高, 因而病毒复制增加[18]. Chan et al[19]研究表明, 慢性HBV感染45例患者HBeAg/抗-HBe转换后92%有CP或前C变异, 其中42%仅CP、38%仅终止密码子、12%同时有2种变异. 血清HBeAg/抗-HBe转换后73%的患者持续血清转氨酶正常, 仅8%有多次增高. 1858 nt是C的基因型感染CP变异较常见(91%∶27%, P<0.01); 而前-C终止密码子仅见于1858 nt, 是T的基因型(87%∶0 P <0.01). CP变异选择妨碍发生前C终止密码子的基因型.

HBV在覆盖CP的区域利用其基因组的经济性是非常明显的, 跨越CP区域(1591-1849 nt)的DNA一定数量的重要功能. 首先, 他包含了在体内具有双重功能的增强子Ⅱ: 其激活下游位点的S及X基因启动子活性和上游位点的 CP启动子活性. 其次, 在这个区域内的BCP调控前-C mRNA和前基因组RNA的转录. 而且, CP的3'末端与编码HBeAg的前C/C ORF的5'末端相互重叠, DR1也包括在此区域内. 再者, CP区与编码X蛋白的X ORF序列重叠, 而X蛋白的C末端以证明具有反式激活作用. 因此一些在CP内的DNA基因序列突变可以影响病毒的复制、HBeAg的生成以及X蛋白的氨基酸序. CP区基因序列的保守性对于维持病毒的活跃复制是非常关键的, 而且他的变异与病毒在宿主体内持续表达导致乙肝病毒慢性感染、最终引起肝细胞癌的发生是密不可分的[20].

备注

$[Footnotes]

参考文献

1.	Yu SJ. A comparative study on proliferating activity between HBV related and HCV related small HCC. ChinaNatl J New Gastroenterol. 1997;3:236-237.  [PubMed]  [DOI]

2.	Guo SP, Ma ZS, Wang WL. Construction of eukaryotic expression vector of HBV x gene. World J Gastroenterol. 1999;5:351-352.  [PubMed]  [DOI]

3.	Tang RX, Gao FG, Zeng LY, Wang YW, Wang YL. Detection of HBV DNA and its existence status in liver tissues and peripheral blood lymphocytes from chronic hepatitis B patients. World J Gastroenterol. 1999;5:359-361.  [PubMed]  [DOI]

4.	Qin LL, Su JJ, Li Y, Yang C, Ban KC, Yian RQ. Expression of IGF- II, p53, p21 and HBxAg in precancerous events of hepatocarcinogenesis induced by AFB1 and/or HBV in tree shrews. World J Gastroenterol. 2000;6:138-139.  [PubMed]  [DOI]

5.	Wang Y, Liu H, Zhou Q, Li X. Analysis of point mutation in site 1 896 of HBV precore and its detection in the tissues and serum of HCC patients. World J Gastroenterol. 2000;6:395-397.  [PubMed]  [DOI]

6.	骆 抗先. 乙型肝炎基础和临床. 第2版. 北京: 人民卫生出版社 2001; 25-33.  [PubMed]  [DOI]

7.	Lopez-Cabrera M, Letovsky J, Hu KQ, Siddiqqui A. Transcriptional factor C/EBP binds to and transactivates the enhancer element II of the hepatitis B virus. Virology. 1991;183:825-829.  [PubMed]  [DOI]

8.	Wang WX, Li M, Wu X, Wang Y, Li ZP. HNF1 is critical for the liver-specific function of HBV enhancer II. Res Virol. 1998;149:99-108.  [PubMed]  [DOI]

9.	Johnson JL, Raney AK, McLachlan A. Characterization of a functional hepatocyte nuclear factor 3 binding site in the hepatitis B virus nucleocapsid promoter. Virology. 1995;208:147-158.  [PubMed]  [DOI]

10.	Raney AK, Johnson JL, Palmer CN, Mclachlan A. Members of the nuclear receptor superfamily regulate transcription from the hepatitis B virus nucleocapsid promoter. J Virol. 1997;71:1058-1071.  [PubMed]  [DOI]

11.	YU X, Mertz JE. Differential regulation of the pre-C and pregenomic promoter of human hepatitis B virus by members of the nuclear receptor superfamily. J Virol. 1997;71:9366-9374.  [PubMed]  [DOI]

12.	Scaglioni PP, Melegari M, Wands JR. Biologic properties of hepatitis B viral genomes with mutations in the precore promoter and precore open reading frame. Virology. 1997;233:374-381.  [PubMed]  [DOI]

13.	Kidd-Ljunggren K, Oberg M, Kidd AH. Hepatitis B virus X gene 1 751 to 1 764 mutations: implications for HBeAg status and disease. J Virol. 1997;78:1469-1478.  [PubMed]  [DOI]

14.	Buckwold VE, Xu Z, Chen M, Yen TS, Ou JH. Effects of a naturally occurring mutation in the hepatitis B virus basal core promoter on precore gene expression and viral replication. J Virol. 1996;70:5845-5851.  [PubMed]  [DOI]

15.	Gunther S, Piwon N, Will H. Wild-type levels of pregenomic RNA and replication but reduced pre-C RNA and e-antigen synthesis of hepatitis B virus with C(1 653)→T, A(1 762) →T and G(1 764)→A mutations in the core promoter. J Gen Virol. 1998;79:375-380.  [PubMed]  [DOI]

16.	Romero R, Lavine JE. Cytokine inhibition of the hepatitis B virus core promoter. Hepatalogy. 1996;23:17-23.  [PubMed]  [DOI]

17.	Baumert TF, Marrone A, Vergalla J, Liang TJ. Naturally occurring mutations define a novel function of the hepatitis B virus core promoter in core protein expression. J Virol. 1998;72:6785-6795.  [PubMed]  [DOI]

18.	Pult I, Chouard T, Wieland S, Klemenz R, Yaniv M, Blum HE. A hepatitis B virus mutant with a new hepatocyte nuclear factor 1 binding site emerging in transplant-transmitted fulminant hepatitis B. Hepatology. 1997;25:1507-1509.  [PubMed]  [DOI]

19.	Chan HL, Hussain M, Lok AS. Different hepatitis B virus genotypes are associated with different mutations in the core promoter and precore regions during hepatitis Be antigen seroconversion. Hepatology. 1999;29:976-984.  [PubMed]  [DOI]

20.	Kramvis A, Kew MC. The core promoter of hepatitis B virus. J Viral Hepat. 1999;6:415-427.  [PubMed]  [DOI]