热休克蛋白在胃溃疡中的表达及意义

摘要

随着对热休克蛋白研究的深入, 热休克蛋白对胃黏膜的保护作用引越来越起人们的重视, 各种热休克蛋白在胃溃疡不同时期的表达, 在保护胃黏膜抵御应激损伤中起着重要作用, 特别是热休克蛋白与幽门螺杆菌之间存在着天然联系, 参与胃溃疡的发生、发展. 因此, 构建热休克蛋白疫苗和采用非毒性HSPs诱导剂对溃疡的预防及促进溃疡愈合具有重要的治疗价值.

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: October 7, 2002
Revised: October 10, 2002
Accepted: October 18, 2002
Published online: May 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)又称应激蛋白(stress protein, SP)是生物细胞在某些环境因素或多种应激条件下, 特别是热刺激下均可诱导新合成或合成增加的一类高度保守的应激蛋白质. HSPs与多种蛋白质在细胞中形成复合体并通过其形成或解离而参与有关蛋白质的折叠、组装、细胞内运输及降解等过程, 以调节靶蛋白的活性和功能. 因此, HSPs又被称为"分子伴侣"(molecular chaperone). HSPs在细胞周期调节、DNA损伤修复、基因产物代谢等过程中起重要作用. 近年来研究发现HSPs可保护胃黏膜免受非甾体类抗炎药引起的损害, 在胃溃疡的愈合和维持黏膜完整、细胞重建中有重要的作用. 消化性溃疡是消化系统常见病, 尽管治疗上已取得突破性进展, 但治疗时间长, 应激刺激下易复发, 如能找出非毒性HSPs诱导剂, 不仅可减少应激性溃疡的发生, 而且可以缩短治疗时间, 提高疗效. 本文就HSPs在胃溃疡愈合过程中的表达和意义作一综述.

1 热休克蛋白的产生及分类

热休克现象是1962年由遗传学家Ritossa在观察受热应激的果蝇唾液腺细胞多丝染色体形态变化时发现, 1974年Tissiers et al发现热休克蛋白广泛存在于人、动物、微生物和植物细胞内, 主要在细胞内发挥功能, 属非分泌型蛋白质, 在细胞内含量相当高, 占细胞内总蛋白的5%, 热休克蛋白家族由多种蛋白组成, 分类方法很多, 目前主要根据分子量大小将热休克蛋白分为４个家族, 即: 热休克蛋白90家族(83-90 KD)、热休克蛋白70家族(66-78 KD)、 热休克蛋白60家族和小热休克蛋白家族(15-39 KD). 不同的HSPs家族不但分子量大小不同, 而且其生物学功能亦有差异, 其中HSP70、HSP60、HSP47、HSP32与胃溃疡关系密切. HSP70家族最丰富最重要, 在高温及各种因素刺激下, HSP70合成明显增加, 参与蛋白的折叠、组装、转运与蛋白复合物的降解DNA的复制与修复等过程, 且广泛参与机体热耐受、炎症及自身免疫等生理、病理过程, 与某些蛋白一起参与细胞增生及调亡过程, 在维持细胞稳定方面具重要作用.

2 热休克蛋白与幽门螺杆菌

幽门螺旋杆菌(Hp)是专嗜人胃黏膜的致病菌, 研究表明Hp与HSPs之间存在着天然的联系, 将Hp菌株置于42 ℃环境下, 采用放射自显影法可观察到细菌表面有HSP60表达. Hp合成的热休克蛋白主要有HSP60 s、HSP10和HSP70. HSP60(又称HspB)在细菌的致病机制中起着重要的作用, 他可介导免疫调节, 触发胃上皮细胞的自身免疫反应, 在胃黏膜病变的发生、发展中充当启动因子; 介导病原与宿主的识别与黏附. 有研究认为HspB、HspA是Hp的又一类重要的定植因子, 在极端不利的理化条件中, 能维持菌体活性蛋白的稳定性, 显著增强尿素酶的活性. Huesca et al提出HSPs与胃黏膜黏附的双受体模型: 即胃内低pH环境上调热休克蛋白70的表达, 表达的热休克蛋白70呈现到细菌表面介导Hp与黏液层的硫苷酯结合, Hp穿过黏膜层后与胃上皮的结合[1,2]. 人类HSP60与Hp的HSPB具有较高同源性, 且与抗Hp多克隆抗体存在交叉反应[3]. Hp感染的胃黏膜疾病中, 以色谱扫描测定HSP70表达水平显示由低到高依次为胃腺癌、慢性胃炎和胃溃疡[4]. Hp(+)的胃炎、DU患者胃黏膜中HSP72的表达明显高于Hp(-)的胃炎、DU患者. 其机制可能为胃黏膜细胞受到Hp感染刺激时所产生的一种自身保护机制, Hp感染引起的外源性刺激因素(Hp脂多糖, 尿素酶, 空泡毒素等)和内源性刺激因素, 使细胞内蛋白质构型发生改变, 产生变性蛋白, 激发细胞的应激反应, 激活热休克基因编码HSP72, 诱导合成的HSP72能促进细胞内蛋白质的合成、折叠、装配、转位, 促使细胞从应激中恢复, 减少黏膜细胞的损伤, 保护胃黏膜[5,6]. 但Konturek et al[7]采用给大鼠阿司匹林2 g/d, 14 d后, 用定量RT-PCR、Western blot 和免疫组化方法检测Hp感染大鼠、Hp根除3 mo后的大鼠HSP70的表达, 结果发现Hp感染鼠的胃黏膜Hsp70的表达下降, 根除鼠有较高的表达, 基础HSP70和阿司匹林诱导的HSP70的表达的减少, 干扰了胃黏膜对Hp的适应性, 削弱了Hp感染者对阿司匹林的适应性. 因此在胃溃疡的形成中起着重要作用.

3 热休克蛋白在胃溃疡中的表达及意义

在正常大鼠胃组织中, 均可检测到HSP70、HSP60、HSP47、HSP32的少量表达, 以黏膜上皮表达较为明显, HSP70存在胞质及细胞膜周围, 而HSP60主要存在胞质, HSP47主要分布于成纤维细胞和血管内皮细胞, 正常胃黏膜胃腺基底的主细胞有微量HSP32表达. 在应激条件下, 胃腺体有多种、大量HSPs表达, 并且核中可见表达. Tsukimi et al[8]发现高水平的HSC70(73 KD)在正常黏膜和乙酸诱导的大鼠胃溃疡组织表达, 在溃疡和溃疡愈合时水平无改变. 而HSP70、HSP47是在溃疡期基底部表达尤为明显, 随溃疡的愈合而减少, HSP70在溃疡的边缘的表达随溃疡愈合渐增加, 奥美拉唑通过促进HSP70在溃疡的边缘和基底的表达、诱导HSP47在溃疡基底的表达、强烈抑制胃酸分泌而加速溃疡的愈合, 而消炎痛轻微抑制胃酸分泌、明显诱导HSP47在胃溃疡基底部的超表达, 延长胃溃疡的愈合. 因此, HSC70的表达与胃溃疡愈合无关, HSP70表达的增加可加速胃溃疡的愈合, 而HSP47的超表达可延缓胃溃疡的愈合. Guo et al[9]发现乙酸诱导的胃溃疡基底肉芽组织中的主要组成细胞(成纤维细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞)HSP47大量表达; HSP32在溃疡模型诱导2 h后丢失, 在6 h后又重现, 以后超过正常值, 3-5 d达高峰, 在溃疡愈合期一直保持高水平, 此期间伴随胃溃疡面积缩小和上皮化; 在溃疡基底HSP70从2 h-5 d减少, 以后恢复正常, 从而提示HSP47作为一种胶原特异的分子伴侣, 积极参与了胃溃疡愈合过程中溃疡组织的修复和重建, HSP32的抗炎作用可能涉及溃疡愈合时内皮细胞的活化增生、血管生成和肉芽组织的形成. Kawai et al[10]发现, 大鼠束缚水浸应激时, 30 min内HSP70和HSP70 mRNA在胃黏膜被诱导合成, 诱导的程度与黏膜损伤程度呈负相关, 表明HSP70在保护胃黏膜抵御应激损伤中起重要作用, 李定国et al[11]采用免疫组化方法检测大鼠束缚水浸应激后HSP的表达, 发现腺体存在HSP70和HSP60大量表达, 并且可见核中表达. 如果采用JPYQR和丽珠得乐预处理, 随后束缚水浸应激, 结果预处理组溃疡指数明显小于模型组, HSP70水平明显高于模型组. 其机制可能为预处理表达的HSP与应激状态下产生的变性蛋白结合, 发挥分子伴侣作用, 从而减少了胃黏膜的损伤.

4 热休克蛋白与溃疡发生的关系

热休克蛋白可提高胃黏膜细胞对应激原的耐受力, 如果热休克蛋白缺乏可降低胃黏膜对攻击因子的防御功能, 易形成溃疡. 用离体的原代培养的豚鼠胃黏膜细胞, 给予43 ℃热应激1 h, 细胞内HSP70合成明显增加, HSP70编码基因转录显著加速, 而且细胞对随后给予的无水乙醇的抵抗耐受力明显加强; 预先给予大鼠高温处理及中药JPYQ或GGA处理均可显著提高HSPs的表达, 并防止大鼠束缚水浸时发生严重胃溃疡, 这种保护作用可被蛋白质合成抑制剂CHM抑制HSPs的表达所阻断[12,13]. Amici et al[14]研究发现阿司匹林可通过诱导和延长HSF(heat shock transcription factor)结合到Hsp70基因的热休克元件上; 抑制环氧化酶, 使细胞膜上花生四烯酸代谢障碍, 从而降低HSF被激活的温度阈值; 增强细胞内HSP70的转录水平, 使HSP70表达明显增高, 从而使胃黏膜对阿司匹林的适应能力增强. 1999年Jin et al[15] 也证实: 胃黏膜对阿司匹林(aspirin)诱导的胃黏膜损害的抵抗力增强与胃黏膜中HSP72表达增加密切相关. 前列腺素是生物体内主要的炎症递质, 近年发现前列腺素及相关物, 如花生四烯酸, 环氧化酶抑制剂, 水杨酸钠, 阿司匹林, 消炎痛等都参与机体热休克蛋白的表达的调控. Nagayama et al[16]研究发现如果用低浓度(30 ml^-1)的乙醇预处理细胞, 也可诱导HSP的表达, 使细胞增加抵御应激引起的损伤, 减少应激性溃疡的发生.

5 热休克蛋白促进溃疡愈合机制的探讨

近年来大多数实验已证实热休克蛋白作为一种细胞内源性保护蛋白, 在防止应激引起的细胞损害或使受损的细胞恢复起重要作用, 但其保护作用机制尚不清楚. 可能有以下几个方面的原因:

5.1 分子伴侣作用

HSP70是研究最多, 也是最重要的内源性保护细胞和组织在病理条件下免受损伤的因子之一, HSP70家族能作为"分子伴侣"与应激状态下变性的蛋白分子结合, 可修复被损伤的前核糖体、防止溶酶体破坏、稳定细胞膜, 从而减轻某些蛋白质的变性和聚合, 维持细胞正常的形态和功能, 对抗有害因素. HSP32在溃疡愈合中持续升高, 参与内皮细胞的活化、增生和血管生成的调节、抗炎、促血管生成和肉芽组织的形成.

5.2 抗凋亡

细胞内的HSP70的增加可抑制蛋白激酶p38(HOG1)和JNK(junN-terminal kinase)的活性、抑制凋亡激活基因p53和Bax的表达、抑制氧自由基的生成、抑制凋亡信号转导中蛋白水解酶(caspases)的活性[17]等多种途径抑制细胞的凋亡, 还能防止线粒体损伤、核碎裂等, 使细胞的生长抑制效应和死亡效应减弱. 有学者将HSPs视为抗凋亡蛋白.

5.3 抵抗损伤

HSPs除能增加细胞的热耐受抵抗损伤外, 还与其他因素损伤细胞时的保护有关, 一氧化氮(NO)对胃黏膜血液供应的调节, 可通过凋亡机制清除中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞, 加速急性炎症的吸收. 但NO过量产生, 会导致过氧化自由基的形成, 对宿主细胞具有毒性作用, 是细胞受损的重要因素, 在溃疡中表现为组织和炎症细胞的坏死、溃疡面积的增大. 正常胃组织无iNOS的mRNA和蛋白质的表达, 溃疡诱导6 h后, 溃疡基底iNOS mRNA和蛋白质的表达快速增加, 1-3 d高峰期, 在溃疡愈合期间快速下降. 其原因可能为HSP70能抑制iNOS基因转录和iNOS的合成, 降低iNOS活性, 减少NO合成, 从而减轻NO等炎症因子对机体的损害作用[18]. 溃疡诱导初期 NO和NO供体可在RNA和蛋白质水平诱导HSP32的表达, 还能稳定HSP32 mRNA, 使其发挥抗氧自由基和促炎症吸收的作用, HSP32对NOS又具有负反馈调节作用[19], 有助于限制过于强烈的iNOS的活性和NO的产生, 减少组织损伤和启动溃疡愈合过程. 因此, HSPs与NOS的相互调节有利于胃黏膜抵抗损伤.

5.4 加速修复

HSPs可识别和清除异常的蛋白质, 加速损害严重、不能修复的蛋白质的降解. 创伤的愈合中修复细胞即以成纤维细胞为主, 有赖于细胞的增生及迁移. 在溃疡的愈合过程中, HSP47作为胶原特异的分子伴侣, 涉及溃疡愈合中肉芽组织和细胞外基质的形成, 细胞外基质在正常的损伤修复和愈合中有重要作用, 促进细胞-细胞间相互作用的调节, 利于细胞移居的几何框架的构建, 但HSP47的过度表达可能破坏正常结构和功能导致纤维化. 近来有学者用可诱导HSP70的药物作用于糖尿病大鼠的背部创面, 结果发现创面愈合加速[20], 说明HSP70能促进创伤愈合.

6 热休克蛋白在胃溃疡治疗中的应用前景

6.1 促进胃溃疡的愈合

基于热休克蛋白能保护细胞、组织、器官及其与胃溃疡愈合的密切关系, 如果能发现临床上安全又能诱导热休克蛋白表达的药, 可望为促进胃溃疡的愈合寻找新的途径, Ooie et al[21]使用一种抗溃疡药二香叶基丙酮GGA(200 mg.g^-1)口服可诱导HSP72在心脏的表达, 预防心肌受损. Hirakawa et al[13]预先给予二香叶基丙酮(GGA)可诱导HSP更高水平的表达并防止胃黏膜发生严重损伤. 近年来有研究者发现生胃酮也能诱导热休克蛋白和mRNA的表达而起促进溃疡愈合的作用[16]. 如果联用硫糖铝或奥美拉唑可明显加速胃溃疡的自然愈合过程. 健脾益气中药也可通过HSPs机制促进溃疡愈合[11].

6.2 减少非甾体类抗炎药的副作用

目前临床治疗时使用非甾体类抗炎药往往会出现胃黏膜损伤, 表现为出血、局灶性坏死、甚至发生溃疡和穿孔, 如果同时使用诱导热休克蛋白表达的药, 可望避免消化道副反应发生. Tomisato et al[22]用乙醇、过氧化氢或盐酸短期处理胃黏膜细胞, 发现细胞膜失去完整性, 致死亡, 而GGA可通过诱导热休克蛋白的表达而保护豚鼠胃黏膜免受应激的损伤.如果必须使用NSAID, 辅以GGA等HSPs诱导剂, 有望减少副作用.

6.3 保护胃黏膜

Kawai et al[10]认为长期给予GGA可刺激低蛋白质营养失调的大鼠的胃黏膜的热休克反应, 这种作用对由于基础疾病影响而很难改善营养状况的慢性消耗性疾病有很好的胃黏膜保护作用.

6.4 构建Hp疫苗

Hp纯化的尿素酶(urease, ure)和热休克蛋白及其亚单位成分可作为抗原刺激机体产生保护性的免疫防御和治疗作用. 李明峰et al[23]将HspA和UreB两个目的基因插入同一表达载体, 已在大肠杆菌得到高效表达, HspA-UreB融合蛋白可能作为一种有效的蛋白质疫苗用于Hp的预防和治疗. 为临床应用提供了新的途径.

备注

$[Footnotes]

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