研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-04-15; 11(4): 478-480
在线出版日期: 2003-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i4.478
中药复方肠安泰对肠癌肺转移模型小鼠肠黏膜固有层B细胞及IL-12的影响
王文萍, 王垂杰, 姜良铎, 飯郷正明
王文萍, 辽宁中医学院附属医院肿瘤内科 辽宁省沈阳市 110032
王垂杰, 辽宁中医学院附属医院消化内科 辽宁省沈阳市 110032
姜良铎, 北京中医药大学东直门医院内科 北京市 100029
飯郷正明, 日本国立癌中心细胞增生实验室 日本东京104-0045
基金项目: 辽宁省科委基金资助课题, No. 962243.
通讯作者: 王文萍, 110032, 辽宁省沈阳市皇姑区崇山东路79号, 辽宁中医学院附属医院. wenpingwang.263.net
电话: 024-23887357 传真: 024-23887357
收稿日期: 2002-11-21
修回日期: 2002-12-10
接受日期: 2003-01-18
在线出版日期: 2003-04-15

目的

探讨中药复方肠安泰对肠管绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12的影响及其与肺转移的关系.

方法

经皮下植入大肠癌高度肺转移细胞(Co26Lu), 建立大肠癌肺转移小鼠动物模型, 采用ABC免疫染色及免疫荧光染色方法做相关分析.

结果

荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比IgA、IgM及IL-12阳性细胞在小肠绒毛黏膜固有层均有显著意义的增加. 两组数值依次为172.3±6.7, 59.2±5.3, 79.6±4.1; 131.2±5.3, 45.1±4.3, 24.4±2.5(P<0.01).

结论

中药复方肠安泰预防大肠癌肺转移的机制, 与其促进了荷瘤小鼠小肠绒毛黏膜固有层B细胞的活化及IL-12的诱导有关.

关键词: N/A

引文著录: 王文萍, 王垂杰, 姜良铎, 飯郷正明. 中药复方肠安泰对肠癌肺转移模型小鼠肠黏膜固有层B细胞及IL-12的影响. 世界华人消化杂志 2003; 11(4): 478-480
N/A
N/A
Correspondence to: N/A
Received: November 21, 2002
Revised: December 10, 2002
Accepted: January 18, 2003
Published online: April 15, 2003

N/A

Key Words: N/A


0 引言

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤, 手术是治疗大肠癌的主要手段, 但术后5 a生存率一直徘徊在50-55 %, 50 a来并无显著提高, 成为手术失败的主要原因. 根据中医基础理论[1]本研究提出肿瘤转移"痰毒流注"病机假说[2-4], 研制中药复方肠安泰进行预防大肠癌转移的研究.实验证明中药复方肠安泰预防大肠癌(Co26 Lu)肺转移机制中, T细胞、NK细胞及细胞因子IFNγ发挥着重要的作用[5,6]. 本实验的目的在于探讨中药复方肠安泰对肠管绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12的影响及其与肺转移的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

♂CDF1系5WK小鼠(购自日本CharlesRiver公司)30只, 体质量23-26 g分笼饲养, 自由饮水, 饲料为繁殖用固性饲料(CLEA日本), 动物室为无菌条件, 控制温度, 12 h明暗周期. 给予1 wk的预备饲养, 待小鼠6 wk时进行实验.中药复方肠安泰为省科委基金课题观察处方, 由藤梨根, 黄芪, 补骨脂, 鸡血藤组成.所有生药均购自辽宁中医学院附属医院, 由辽宁中医学院中药系醇提精制成干膏. 山羊抗小鼠IgA抗体, 工作浓度1: 16, 山羊抗小鼠IgM抗体, 工作浓度1: 128, 购于美国Sigma公司, 大鼠抗小鼠IL-12抗体, 工作浓度2 kg/L, 购于美国PharMingen公司, ABC免疫组化试剂盒购于美国VectorLaboratories.Inc公司. 大肠癌高度肺转移细胞(Co26Lu)由日本国立癌中心飯郷正明惠赠.

1.2 方法

将小鼠随机分成正常对照组、荷瘤对照组及荷瘤治疗组, 每组10只小鼠. 正常对照组为非造模组. 荷瘤对照组为造模组: 将Co26Lu细胞皮下注入小鼠右大腿, 每只0.1 mL, 含1×105个癌细胞.荷瘤治疗组: 从小鼠造模后3 d开始, 每天灌胃予肠安泰0.75 g/Kg, 持续给药18 d. 正常对照组, 荷瘤对照组小鼠于每日相同时间, 用相同方法给予等量生理盐水. 灌胃18 d后24 h, 乙醚麻醉小鼠, 解剖取小肠、大肠, 4 ℃丙酮固定, 标本切除, 石蜡包埋, 制成3 μM切片备用. 小肠、大肠的IL-12细胞均采用ABC免疫组化方法染色, 方法参见试剂盒说明书进行.主要步骤为: 切片按常规脱蜡处理至水, 1 mL/L牛奶浸泡20 min, PBS漂洗5 min, 每片加入一抗20 ml, 室温2 h, PBS漂洗3次各5 min, 在含30 mL/L的H2O2的Metoh中浸泡5 min, PBS漂洗3次各5 min, 加入二抗(黄色液3滴, 蓝色液1滴)20 μl, 室温1 h, PBS漂洗15 min, 加入(ABC盒的A液2滴, B液2滴)20 μl, 常温1 h, PBS漂洗3次各5 min, 0.1 g/L的DAB/0.3 mL/L的H2O2显色, 流水冲洗10 min, 苏木紫核染色2 sec, 经过脱水, 透澈及封入剂封入. 在高倍光镜下, 随机观察相连10个绒毛, 计数小肠、大肠的绒毛黏膜固有层的IL-12阳性细胞数, IL-12阳性细胞在细胞核上出现棕色颗粒. 免疫荧光染色: 切片按常规脱蜡处理至水, 1 mL/L的牛奶浸泡20 min, PBS漂洗5 min, 加入含有FITC的一次抗体, 室温放置60 min, 用PBS洗3次, 干燥后加盖玻片, 暗处保存.在高倍光镜下, 随机观察相连10个绒毛, 计数小肠、大肠的绒毛黏膜固有层的IL-12阳性细胞及IgA, IgM阳性细胞数, IgA, IgM阳性细胞在细胞核上出现荧光.

统计学处理 数据以均数±标准差(mean±SD)表示, 采用日本医学统计软件, 组间IgA、IgM及IL-12阳性细胞的对比用Dunnett's T检验.

2 结果
2.1 小肠绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12(表1)
表1 中药复方肠安泰对肠绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12的影响(n =10, mean±SD 阳性细胞数/10个肠绒毛).
分组IgAIgMIL-12
小肠 正常对照组88.6±3.226.7±3.618.2±2.1
荷瘤对照组131.2±5.3a45.1±4.3a24.4±2.5
荷瘤治疗组172.3±6.7a59.2±5.3a79.6±4.1a
大肠 正常对照组42.7±2.618.4±1.910.5±1.6
荷瘤对照组50.1±3.226.7±2.116.1±1.9
荷瘤治疗组65.4±4.1b30.0±2.925.6±2.1b

小肠绒毛黏膜固有层的IgA、IgM阳性细胞数, 荷瘤对照组与正常对照组相比, 均有显著增高, 有统计学意义(P<0.01). 荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比也具有显著性差别(P<0.01); 小肠绒毛黏膜固有层的IL-12阳性细胞数, 荷瘤对照组与正常对照组相比, 有增高趋势, 但无统计学意义.荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比具有显著性增高(P<0.01).

2.2 大肠绒毛黏膜固有层B细胞及IL-12(表1)

荷瘤对照组与正常对照组相比, 大肠绒毛黏膜固有层的IgA、IgM及IL-12阳性细胞均有增高趋势, 但无统计学意义.大肠的荷瘤治疗组与荷瘤对照组相比IgM有增高趋势, 但无统计学意义, 而IgA及IL-12组有统计学意义(P<0.05).

3 讨论

肠道黏膜是一个非常复杂的免疫部位或免疫器官, 黏膜淋巴细胞具有归巢性, 口服具有免疫作用的药物可以引起黏膜的免疫反应, 也能引起系统免疫反应, 因此黏膜是宿主防御的第一道防线. 肠道黏膜固有层的淋巴细胞LPL位于上皮层下, 是黏膜免疫系统MIS受作用于黏膜表面的特异抗原物质发展而成, 在预防肿瘤转移中发挥着重要的作用[7-10].

阻止肿瘤转移免疫机制的研究多从T淋巴细胞角度探讨[11-15]. 对体液免疫研究者较少, 有临床研究发现大肠癌患者的免疫球蛋白中的IgG, IgM处于正常水平, 而IgA则明显低于正常值[16]. 本实验显示肿瘤(Co26Lu)发生及肿瘤转移初期, 小肠的肠管绒毛黏膜固有层的IgA及IgM B细胞均有增加趋势, 但这种程度的增加, 仅仅是机体产生的肿瘤免疫反应或是免疫刺激, 并未能达到抑制肿瘤生长及转移的作用. 而中药复方肠安泰显著地、有意义地增加了荷瘤小鼠IgA, IgM B细胞及细胞因子IL-12在小肠绒毛黏膜固有层的分布.表明中药复方肠安泰抗大肠癌肺转移(Co26Lu)的机制与B细胞和细胞因子IL-12在小肠内增加有关, IL-12的抗肿瘤作用特别是其抗转移活性尤其令人注目[17-22]. 许多肿瘤动物实验模型表明, IL-12可在肿瘤的微环境中达到持久的局部浓度, 能抑制肿瘤的生长或使肿瘤完全消退, 阻止恶性转移, 抑制远处肿瘤的生长[23-27]. 更重要的是, IL-12使一些动物显示持久的系统免疫, 对肿瘤的再攻击具有保护作用[28-31]. IL-12通过调节NK细胞、巨噬细胞介导的非特异性免疫和Th细胞、细胞毒性T细胞介导的特异性免疫作用[32].

过去实验表明中药复方肠安泰能够增加T细胞及NK细胞在小肠黏膜固有层的数量[5], 并能通过诱导IFNγ的产生而抑制肿瘤生长和转移[6]. 也就是说中药复方肠安泰一方面在来源于B细胞的IL-12介导下, 产生IFNγ而发挥抗肿瘤转移的作用, 另一方面诱导产生的IL-12的抗肿瘤作用可能是由于CD8+T、NK细胞所介导的. 在整个免疫应答过程中, 小肠黏膜固有层淋巴细胞起主导作用, 大肠黏膜固有层淋巴细胞起辅助作用.

1.  王 文萍, 姜 良铎. 肿瘤转移器官特异性发生机制与中医经络藏象理论. 北京中医药大学学报. 2002;25:11-13.  [PubMed]  [DOI]
2.  王 文萍, 王 垂杰, 姜 良铎. 肿瘤转移"痰毒流注"理论形成基础及实践意义. 中国中医基础医学杂志. 2002;8:324-326.  [PubMed]  [DOI]
3.  王 文萍, 王 垂杰. 中医学对大肠癌肿瘤转移的认识及对策. 中医药学刊. 2002;1:41-42.  [PubMed]  [DOI]
4.  王 文萍, 姜 良铎, 刘 明. 肿瘤转移"痰毒流注"病机假说的研究思路. 辽宁中医杂志. 2002;3:137-138.  [PubMed]  [DOI]
5.  王 文萍, 姜 良铎, 王 垂杰, 飯 郷正明. 中药复方肠安泰胶囊对大肠癌肺转移模型小鼠肠黏膜T细胞及NK细胞的诱导. 北京中医药大学学报. 2001;4:34-36.  [PubMed]  [DOI]
6.  王 文萍, 姜 良铎, 王 垂杰, 飯 郷正明. 肠安泰对 IFNγ 的诱导及肺转移的抑制. 中国中医基础医学杂志. 2002;12:23-24.  [PubMed]  [DOI]
7.  Mowat AM, Smith RE, Donachie AM, Furrie E, Grdic D, Lycke N. Oral vaccination with immune stimulating complexes. Immunol Lett. 1999;65:133-140.  [PubMed]  [DOI]
8.  Angstrom J, Backstrom M, Berntsson A, Karlsson N, Holmgren J, Karlsson KA, Lebens M, Teneberg S. Novel carbohydrate binding site recognizing blood group A and B determinants in a hybrid of cholera toxin and Escherichia coli heat-labile enterotoxin B-subunits. J Biol Chem. 2000;275:3231-3238.  [PubMed]  [DOI]
9.  Del Giudice G, Pizza M, Rappuoli R. Mucosal delivery of vaccines. Methods. 1999;19:148-155.  [PubMed]  [DOI]
10.  Wang WP, Iigo M, Sato J, Sekine K, Adachi I, Tsuda H. Activation of intestinal mucosal immunity in tumor-bearing mice by lactoferrin. Jpn J Cancer Res. 2000;91:1022-1027.  [PubMed]  [DOI]
11.  王 文萍, 飯 郷正明, 津 田洋幸. 大肠癌及癌转移的预防与Lactferrin. 肿瘤学杂志. 2002;1:55-56.  [PubMed]  [DOI]
12.  吕 仁荣, 寿 楠海, 姜 希宏. 大肠癌细胞增生活性和细胞免疫水平与淋巴结转移规律的研究. 世界华人消化杂志. 2001;9:455-456.  [PubMed]  [DOI]
13.  吴 金生, 谭 文军, 赖 大年. 胃癌术后输注脂肪乳对IL-12及细胞免疫功能的影响. 世界华人消化杂志. 2000;8:712-713.  [PubMed]  [DOI]
14.  李 明松, 袁 爱力, 张 万岱, 陈 学清, 张 亚历, 周 殿元. 大肠癌患者外周血树突状细胞免疫功能研究. 世界华人消化杂志. 1999;7:429.  [PubMed]  [DOI]
15.  赵 任, 郁 宝铭, 郑 民华, 李 东华, 张 国弛, 朱 佑明, 胡 宝瑜. 硒对淋巴细胞杀伤大肠癌细胞的影响. 世界华人消化杂志. 2000;8:80-83.  [PubMed]  [DOI]
16.  赵 任, 郁 宝铭, 张 国弛, 郑 民华, 李 东华, 黄 梁, 邹 鸿志. 手术前后补硒对大肠癌患者的免疫功能及抗氧化功能的影响. 世界华人消化杂志. 2000;8:1013-1016.  [PubMed]  [DOI]
17.  Martinet O, Ermekova V, Qiao JQ, Sauter B, Mandeli J, Chen L, Chen SH. Immunomodulatory gene therapy with interleukin 12 and 4-1BB ligand: long- term remission of liver metastases in a mouse model. J Natl Cancer Inst. 2000;92:931-936.  [PubMed]  [DOI]
18.  Wang Z, Qiu SJ, Ye SL, Tang ZY, Xiao X. Combined IL-12 and GM-CSF gene therapy for murine hepatocellular carcinoma. Cancer Gene Ther. 2001;8:751-758.  [PubMed]  [DOI]
19.  Rakhmilevich AL, Janssen K, Hao Z, Sondel PM, Yang NS. Interleukin-12 gene therapy of a weakly immunogenic mouse mammary carcinoma results in reduction of spontaneous lung metastases via a T-cell-independent mechanism. Cancer Gene Ther. 2000;7:826-838.  [PubMed]  [DOI]
20.  Fuji N, Ueda Y, Fujiwara H, Toh T, Yoshimura T, Yamagishi H. Antitumor effect of alpha-galactosylceramide (KRN7000) on spontaneous hepatic metastases requires endogenous interleukin 12 in the liver. Clin Cancer Res. 2000;6:3380-3387.  [PubMed]  [DOI]
21.  Worth LL, Jia SF, Zhou Z, Chen L, Kleinerman ES. Intranasal therapy with an adenoviral vector containing the murine interleukin-12 gene eradicates osteosarcoma lung metastases. Clin Cancer Res. 2000;6:3713-3718.  [PubMed]  [DOI]
22.  Iwazawa T, Chau GY, Mori T, Dookeran KA, Rubin JT, Watkins S, Robbins PD, Lotze MT, Tahara H. Potent antitumor effects of intra-arterial injection of fibroblasts genetically engineered to express IL-12 in liver metastasis model of rat: no additional benefit of using retroviral producer cell. Cancer Gene Ther. 2001;8:17-22.  [PubMed]  [DOI]
23.  Mariani E, Meneghetti A, Tarozzi A, Cattini L, Facchini A. Interleukin-12 induces efficient lysis of natural killer-sensitive and natural killer-resistant human osteosarcoma cells: the synergistic effect of interleukin-2. Scand J Immunol. 2000;51:618-625.  [PubMed]  [DOI]
24.  Nakui M, Ohta A, Sekimoto M, Sato M, Iwakabe K, Yahata T, Kitamura H, Koda T, Kawano T, Makuuchi H. Potentiation of antitumor effect of NKT cell ligand, alpha-galactosylceramide by combination with IL-12 on lung metastasis of malignant melanoma cells. Clin Exp Metastasis. 2000;18:147-153.  [PubMed]  [DOI]
25.  Kishida T, Asada H, Satoh E, Tanaka S, Shinya M, Hirai H, Iwai M, Tahara H, Imanishi J, Mazda O. In vivo electroporation-mediated transfer of interleukin-12 and interleukin-18 genes induces significant antitumor effects against melanoma in mice. Gene Ther. 2001;8:1234-1240.  [PubMed]  [DOI]
26.  Shin T, Nakayama T, Akutsu Y, Motohashi S, Shibata Y, Harada M, Kamada N, Shimizu C, Shimizu E, Saito T. Inhibition of tumor metastasis by adoptive transfer of IL-12-activated Valpha14 NKT cells. Int J Cancer. 2001;91:523-528.  [PubMed]  [DOI]
27.  Smyth MJ, Cretney E, Takeda K, Wiltrout RH, Sedger LM, Kayagaki N, Yagita H, Okumura K. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) contributes to interferon gamma-dependent natural killer cell protection from tumor metastasis. J Exp Med. 2001;193:661-670.  [PubMed]  [DOI]
28.  Melero I, Mazzolini G, Narvaiza I, Qian C, Chen L, Prieto J. IL-12 gene therapy for cancer: in synergy with other immunotherapies. Trends Immunol. 2001;22:113-115.  [PubMed]  [DOI]
29.  Mikyskova R, Bubenik J, Mendoza L, Vonka V, Smahel M, Simova J, Jandlova T. Local cytokine treatment of HPV16-associated tumours results in inhibition of their lung metastases. Clin Exp Metastasis. 2000;18:581-587.  [PubMed]  [DOI]
30.  Gambotto A, Tuting T, McVey DL, Kovesdi I, Tahara H, Lotze MT, Robbins PD. Induction of antitumor immunity by direct intratumoral injection of a recombinant adenovirus vector expressing interleukin-12. Cancer Gene Ther. 1999;6:45-53.  [PubMed]  [DOI]
31.  Aruga A, Tanigawa K, Aruga E, Yu H, Chang AE. Enhanced adjuvant effect of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-12 compared with either alone in vaccine-induced tumor immunity. Cancer Gene Ther. 1999;6:89-95.  [PubMed]  [DOI]
32.  杨 家和, 钱 其军, 吴 孟超, 郭 亚平. 白介素12: 重要的免疫调节因子. 世界华人消化杂志. 1999;7:71-72.  [PubMed]  [DOI]