乙型肝炎病毒对细胞信号转导的影响

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Correspondence to: N/A

Received: October 29, 2002
Revised: November 10, 2002
Accepted: November 18, 2002
Published online: April 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒的一种, HBV DNA长度为3.2 kb, 具有4个开放读码框架(ORF), 分别编码HBV的表面抗原蛋白, 核心/e抗原, X蛋白以及HBV DNA的聚合酶. 此外, HBV DNA结构中还有4段启动子、2段增强子以及与HBV DNA复制过程密切相关的顺向重复序列1、2（DR1、DR2）等[1]. 感染肝细胞之后, HBV对于肝细胞的信号转导系统的影响, 不仅是HBV蛋白对于肝细胞中信号转导的影响, 还包括肝细胞蛋白与HBV DNA调节序列的结合及其调节. 但是, HBV蛋白对于肝细胞信号转导通路的影响是HBV感染以后形成慢性感染、肝纤维化、肝细胞癌的重要的分子生物学机制[2].

1 HBV与MAPK信号转导系统

在HBV蛋白反式激活研究中, 发现HBV S基因编码的表面抗原大蛋白(LHBs)和C-末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)都是HBV基因组编码的反式激活蛋白, 其反式激活作用主要取决于前-S2位点在细胞质中的朝向[3-5]. MHBs^t是一种蛋白激酶C(PKC)依赖型的反式激活剂, 在Ser28位点上发生磷酸化修饰. 这一磷酸化位点的存在是决定其反式激活作用的关键结构基础. MHBs^t触发PKC依赖性的c-Raf-1/Erk2信号转导系统, 这是MHBs^t激活转录因子蛋白AP-1 和NF-kB的先决条件. 为了研究这种反式激活作用的生理和病理学意义, Hildt et al [6]建立了肝脏特异性表达MHBs^t的转基因小鼠模型, 发现c-Raf-1/Erk2信号转导系统处于持续激活状态, 造成肝脏细胞处于持续增生状态. 超过15月龄的转基因小鼠, 肝脏肿瘤的发生率显著升高. 这些研究资料表明, LHBs和MHBs^t这些具有反式激活作用的病毒蛋白, 通过增生控制关键酶促进肿瘤的形成.

HBV的X蛋白在慢性HBV感染的肝癌形成过程中具有十分重要的作用[7]. Lee et al [8]利用四环素调节系统, 建立了稳定转染的分化(3pX-1)和去分化(4pX-1)的肝细胞系, 只有3pX-1细胞系通过Ras-Raf-MAP的激活导致肝细胞的恶性转化, 表达HBxAg的4pX-1细胞系只有持续的c-jun N-末端激酶(JNK)激活, 但没有恶性转化功能. 为了阐明3pX-1和4pX-1细胞系的这种差别, 首先对其生活周期的调节进行了研究. 表达HBxAg的3pX-1细胞系表现出G1、S和G2/M期的进展, 主要表现在细胞周期素D1、A和B1表达水平的升高, 以及细胞周期素依赖性激酶Cdc2激酶的激活. 表达HBxAg的4pX-1细胞系, 则表现出G1、S的进入, 之后便是S期的停止, 以及Cdc2激酶激活缺如. 有意思的是4pX-1细胞具有选择性的HBxAg诱导的细胞周期素依赖性激酶抑制因子p21(Cip1)、肿瘤抑制因子p19(ARF)和细胞凋亡诱导基因bax、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)的表达. 尽管HBxAg的表达诱导出现了生长阻滞和细胞凋亡基因的表达, 以及缺乏HBxAg依赖性Cdc2的激活, 但是4pX-1细胞系未能出现HBxAg依赖性的G2/M期阻滞或细胞凋亡. 受到抗肿瘤药噻氨酯达唑(Nocodazole)处理以后, 4pX-1 细胞出现G2/M期阻滞, 并出现HBxAg依赖性的多核细胞的形成, 类似人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)Tax蛋白转化的细胞性质. 认为在4pX-1细胞中, HBxAg的表达异常调节了G2/M周期的检验点, 因而阻断了HBxAg蛋白表达诱导的细胞凋亡.

HBxAg的表达及其肝细胞中多种不同基因表达的异常调节是HBV感染引起肝细胞癌的重要分子生物学机制. 但以表达HBxAg的表达载体转染可以感染HBV的成人肝细胞, 却没有发现恶性转化的现象. Nijhara et al [9]利用肝细胞特异性的病毒表达载体, 对HBxAg的体内作用及机制进行了研究. 发现以病毒体方式转染HBxAg的DNA, 可以使>50 %的肝细胞表达HBxAg, 而且还有剂量依赖性特征. 在表达HBxAg的转基因小鼠的肝脏中细胞外信号调节激酶(ERKs)的表达水平显著上升. 静脉注射ERKs中的抑制剂PD98 059, 可以抑制ERKs的激活, 说明HBxAg MEK在激活ERKs的重要性. HBxAg诱导的ERK活性, 可以持续30 d. 同时见到JNKs的持续激活也可以达到30 d. 这种持续的ERK和JNK的激活, 也同时导致下游的一些信号转导途径的持续激活, 例如c-Jun和c-Fos蛋白的持续表达以及AP-1转录因子功能的持续存在. 这些都支持HBxAg在肝细胞的恶性转化中具有十分重要的作用.

HBxAg似乎通过异常激活RAS-RAF-MAPK和JNK信号转导途径参与肝细胞恶性转化的过程. Tarn et al [10]建立了表达HBxAg的AML12永生细胞系, 包括分化的3pX-1细胞系和去分化的4pX-1的细胞系. 结果表明, HBxAg的条件表达, 仅导致3pX-1细胞发生恶性转化, 本研究对于体外酶学活性进行了比较, 体内研究发现HBxAg逆向激活3pX-1细胞系的RAS-RAF-MAPK和JNK系统, 在细胞系4pX-1则无此现象. 持续的HBxAg依赖性的RAS-RAF-MAPK激活, 在3pX-1细胞系中可以见到, 但HBxAg依赖性的JNK系统激活则仅见于未发生恶性转化的4pX-1细胞系. HBxAg激活不同的激酶系统, 导致不同的cAMP-应答元件结合蛋白和c-Jun等的反应不同, 从而决定了3pX-1和4pX-1细胞系生长特性的差别. 在细胞核中定位表达的HBxAg的变异体, 激活RAS-RAF-MAPK系统的能力较弱, 恶性转化作用显著降低. 因此认为HBxAg持续表达与RAS-RAF-MAPK的持续激活是肝细胞恶性转化的重要机制.

研究发现, 蛋白激酶C(PKC)和丝裂原激活蛋白(MAPK)可以使重组的HBxAg蛋白发生磷酸化. 尽管体外PKC和MAPK可以使HBxAg发生磷酸化, 但蛋白激酶A(PKA)或酪蛋白激酶II(caseine kinase II, CKII)却不能使HBxAg发生磷酸化. PKC或MAPK导致HBxAg丝氨酸位点上发生磷酸化[11]. 研究表明HBxAg可通过对Sp1的影响调节胰岛素样生长因子II(IGF II)启动子4(P4)的表达活性[12,13]. PKC和HBxAg通过Sp1调节IGF-II P4转录活性, PKC激活后, 或持续表达PKC的载体转染以后, 可以提高Sp1的磷酸化水平, 还可以提高HBxAg转染的HepG2细胞中IGF-II P4的转录活性. PKC的抑制剂Go6976抑制PKC的活性后, 可以降低Sp1的磷酸化修饰, 降低IGF-II P4的转录活性, 以及IGF-II mRNA的表达水平. 以MAPK细胞外信号调节激酶(MEK)的抑制剂U0126抑制细胞中MEK的激活, 降低Sp1的磷酸化, 降低P4转录活性和IGF-II mRNA的转录水平, 这些研究结果表明, PKC和p44/p42 MAPK信号转导链在Sp1介导的 IGF-II基因表达激活中具有十分重要的意义.

2 HBV与细胞JAK-STAT信号转导系统

在肝细胞癌形成的早期阶段, HBxAg抑制p53蛋白的功能, 晚期阶段有突变的p53蛋白的不断累积, HBxAg抑制细胞凋亡, 但同时也具有诱导细胞凋亡的功能. HBxAg对于细胞凋亡的调节作用, 不仅在肝细胞癌的形成过程中具有重要意义, 在慢性HBV感染的形成过程中也具有十分重要的意义. HBxAg对损伤DNA的修复具有抑制作用, 主要是通过p53 或其他损伤DNA结合蛋白(DDB)之间的结合实现的. 此外, HBxAg能够激活细胞的信号转导链, 如MAPK和JAK/STAT信号转导系统等. 这些都与肝细胞癌的形成过程有关[14]. 在表达HBV蛋白的细胞系中, JAK/STAT信号转导通路发生异常[15]. HBxAg在HBV DNA复制和HCC的形成过程中都具有十分重要的作用.但HBxAg的作用机制目前还不十分清楚. HBxAg对于多种信号转导系统都有重要的调节作用, 包括对Ras/MAPK信号转导链的激活和p53的抑制. Lee et al [16]的研究表明HBxAg可以激活Jak-STAT信号转导系统, 第一步, 首先建立了持续表达HBxAg的细胞系, 并研究了STAT3和STAT5的酪氨酸位点的磷酸化修饰, 证实HBxAg可以持续激活这两种转录因子蛋白. 同时, HBxAg可以提高STAT的DNA结合能力和转录激活作用. HBxAg可以特异性地提高酪氨酸磷酸化水平, 及体内 Jak1的激酶活性, 但对于Jak2或Tyk2没有影响, 这种作用主要是通过HBxAg与Jak1之间的蛋白-蛋白相互作用而实现的. 这些结果清楚地表明HBxAg可以作为JAK/STAT信号转导系统的诱导剂, 从而可以解释HBxAg在肝脏疾病形成过程中作用机制的多样性.

3 乙型肝炎病毒与c-raf-1/Erk2信号转导

LHBs和MHBs^t是HBV DNA编码的反式激活作用蛋白家族的两个重要成员. 这二种反式激活蛋白的作用主要依赖于前-S2位点在细胞质内的朝向. HBsAg中蛋白羧基末端截短型是一种复杂的反式激活剂. HBsAg中蛋白羧基末端截短型可以在PKC的催化下发生Ser28位点的磷酸化修饰. 这一磷酸化修饰位点的完整性是其反式激活作用的结构基础. 截短型HBsAg中蛋白触发PKC依赖性的c-Raf-1/Erk2信号转导途径, 激活转录因子AP-1的NF-kB的表达. Hildt et al [17]建立了肝脏特异性表达截短型HBsAg蛋白的转基因小鼠, 可以观察到前-S2位点依赖性的持续的c-Raf-1/Erk2信号转导系统的激活, 导致肝细胞增生水平的提高. 在15月龄的转基因小鼠中, 肝脏肿瘤的发生率显著提高. 提示HBsAg大蛋白和羧基末端截短型的HBsAg中蛋白通过对于关键酶的活性调节发挥促癌作用.

流行病学调查结果表明, HBV携带者罹患HCC的危险度是HBV非携带者的10倍. 几乎所有的HBV相关性肝细胞癌(HCC)都有HBV DNA与肝细胞染色体的整合. 整合的HBV DNA可以编码两种反式激活蛋白分子, 即HBxAg和前-S2反式激活剂, 包括HBsAg大蛋白和中蛋白的羧基末端截短形式. 前-S2的激活作用决定于前-S2位点在细胞质中的朝向. 前-S2位点的作用是PKC依赖性的磷酸化修饰. 前-S2与PKCα/β亚单位结合, 触发PKC依赖性的c-Raf-1/MAP2激酶信号转导链, 造成转录因子AP-1和NF-kB等的激活. 另外, 通过这一信号转导链的激活, 前-S2反式激活剂可以提高肝细胞的增生能力. 根据肿瘤形成的"二步"理论(发癌和促癌), 前-S2反式激活剂通过激活PKC/c-Raf-1/MAP2-激酶链, 起到促癌的作用. 含有关键性突变位点的细胞(处于发癌阶段的细胞)在表达这一反式激活剂时, 就容易被选择出来, 进入促癌阶段[18,19]. 这种肝癌发生的多阶段特点可能是解释HCC发生、发展需要很长时间的特点.

C-末端发生缺失突变的HBsAg中蛋白, 是一种转录激活蛋白. 这种反式激活作用依赖于HBsAg中蛋白前-S2的N-末端在细胞质中的朝向. 野生型HBsAg中蛋白, 前-S2位点随着翻译过程的进行, 转位到内质网(ER)腔内. 研究结果[20]表明, HBsAg大蛋白的前-S2位点在翻译之后, 首先位于ER膜的胞质面, 因此如何解释HBsAg大蛋白与截短型HBsAg中蛋白具有类似的反式激活作用, 目前还没有定论. HBsAg大蛋白与截短型HBsAg中蛋白一样, 可以激活一系列的启动子元件. 有足够的资料表明, PKC依赖性的AP-1和NF-kB 的激活是HBsAg大蛋白作用的主要机制. 在PKC作用的下游, c-Raf-1激酶是HBsAg大蛋白激活AP-1和NF-kB的先决条件, 因为抑制c-Raf-1激酶的活性, 就可以阻断HBsAg大蛋白对AP-1 和NF-kB的反式激活作用.

备注

$[Footnotes]

参考文献

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