基因芯片技术在肝炎病毒研究中的应用

摘要

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Correspondence to: N/A

Received: October 29, 2002
Revised: November 10, 2002
Accepted: November 18, 2002
Published online: April 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

基因芯片(gene chip)也称为DNA微距阵(DNA microarray)、DNA芯片(DNA chip)等, 是近年发展起来的一项前沿生物技术. 他是指将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地高密度地排列固定于玻片、硅片等固相载体上, 然后与待测的标记样品的基因按碱基互补配对原理进行杂交, 通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描, 再经计算机软件处理, 从而获取大量生命信息. 该技术可以将极其大量的探针同时固定于支持物上, 所以一次可以对大量的生物分子进行检测分析, 从而解决了传统核酸印记杂交(southern blotting和northern blotting等）技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足. 该技术的出现使全面综合分析某些生命现象成为可能.基因芯片技术在疾病基因和各种病原体的诊断、基因表达谱、基因功能、基因突变、病毒检测、发现新基因、疾病发生发展的分子机制、基因药物设计及药物筛选等生物医学领域具有广泛的应用价值[1-6].在肝炎病毒的研究中也有十分重要的应用前景.

1 指导临床治疗

临床上, 在药物疗效与副作用方面, 患者的反应有很大差异, 主要是由于个体遗传学上存在差异(单核苷酸多态性, SNP), 导致对药物产生不同的反应. 利用基因芯片技术可以对患者先进行诊断再针对每个患者具体情况实施个体优化治疗.此外, 在治疗中, 许多同种疾病的具体病因是因人而异的, 用药也应因人而异.例如, HBV有较多亚型, HBV基因的多个位点(S、P及C基因区)容易发生变异[7-10]. 如将这些基因突变部位的全部序列构建为HBV基因多态性检测芯片, 则可对肝炎病毒基因组的突变、基因准种(quasispecies)特点及优势种群的漂变(shift)等特点进行监测, 快速地检测患者是这一个或那一个或多个基因同时发生突变, 从而可以对症下药, 这对指导用药和防止HBV耐药性很有意义.

拉咪呋啶是目前治疗HBV感染的主要药物之一, 该药为核苷类似物, 能够与HBV DNA多聚酶YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸) 基序特异性结合, 防止复制中间体的延伸, 从而起到抑制病毒复制的作用.在药物和人体免疫选择压力下, YMDD基序易发生二种突变株, 即蛋氨酸-异亮氨酸(M-I)和蛋氨酸-缬氨酸(M-V), 突变的HBV对拉咪呋啶不再敏感[11].目前对变异株的检测与分析仅限于RT-PCR产物序列测定法, 单链构象多态性分析与温度梯度凝胶电泳法以及凝胶转移法等.这些方法存在着方法烦琐、费时、只能检测单个位点突变、不能提供全面的变异株情况等特点.基因芯片因其高通量的特点在这方面具有巨大潜力. 可以应用基因芯片技术检测YMDD基序的突变, 对乙肝患者接受治疗时(尤其是在治疗中出现症状反复的患者)的治疗方案选择非常重要.

2 丙型肝炎病毒(HCV)分型检测

HCV感染不但可引起急、慢性病毒性肝炎, 而且可导致肝纤维化(LC), 甚至肝细胞癌(HCC). 在日本, 丙型肝炎是肝癌的最主要原因, 在我国肝癌患者中丙肝或合并丙肝的比例也不低, 因此在感染早期进行治疗是十分必要的, 国内外的临床治疗研究表明: 干扰素的治疗效果与HCV的基因(亚)型的种类有关.干扰素对3 a型的患者治疗效果最好, 1 a型次之, 1 b则几乎没有疗效[12-20].干扰素价格昂贵而且副反应很大, 因此, 在治疗前应用基因芯片检测患者体内的HCV基因(亚)型, 能为患者提供更有效的治疗方案.

3 研究疾病的分子生物学发病机制

肝炎病毒感染肝细胞以后, 肝炎病毒蛋白的表达, 不仅对于肝炎病毒的生活周期具有重要意义, 而且对于肝细胞基因表达谱产生重要影响. 肝炎病毒蛋白无论是在细胞核中分布直接影响肝细胞的基因表达, 还是通过与转录因子蛋白之间的作用间接影响肝细胞的基因表达, 都会对肝细胞的基因表达谱产生显著的影响. 这也是肝炎病毒感染肝细胞以后形成慢性感染、肝纤维化和肝细胞癌的重要的分子生物学机制[21-23]. 我们曾经应用表达谱基因芯片技术研究HCV核心蛋白作用于肝母细胞瘤细胞系HepG2后, 肝细胞基因表达谱的变化, 发现多种与细胞生长调节、细胞凋亡、细胞信号传导通路密切相关的基因表达上调或下调, 对于从总体水平全面了解HCV致病的分子生物学机制具有重要意义. HCV非结构蛋白在病毒复制和肝病病理过程中同样起着重要作用. cDNA表达谱芯片可观察非结构蛋白对肝癌细胞基因表达的影响. 用cDNA芯片检测HCV非结构蛋白诱导下肝癌细胞株的生长、代谢过程、细胞周期及转录因子的变化, 发现这些表达的基因与病毒感染与肝癌形成有着密切联系, 为病毒的致癌机制研究提供线索, 同时也为抗病毒研究提供有力依据.

目前的基因芯片技术存在二个突出的缺点, 一个是假阳性率偏高, 一个是需要首先对检测标本进行多聚酶链反应(PCR)扩增. 假阳性率太高, 严重影响其临床应用的价值, 而需要首先进行扩增, 徒然增加了操作的复杂性, 而不是直接对标本进行检测, 相对于PCR检测技术并没有明显的操作简化, 这也是限制基因芯片技术广泛应用的重要原因. 相对于基因诊断来说, 基因芯片技术假阳性率偏高并不影响其在发病机制研究中的应用, 因为通过基因芯片技术所筛选得到的信息只是初步的, 还需要通过Northern Blotting杂交等下游的分子生物学技术进行证实, 因此不受这一缺点的影响.基因芯片高通量筛选的特点, 可以使这种研究的效率得到显著的提高, 这是其显著的优点.

此外, 对于肝癌组织与正常肝脏组织基因表达谱的比较研究, 对于阐明肝癌发生的分子生物学机制、寻求新型肝癌诊断的分子生物学标志也具有十分重要的意义.

4 研究新型药物与疫苗

新药作用机制的研究其关键的内容之一就是药物作用靶点的确定, 应用基因芯片技术, 选择合适的药物作用的靶细胞, 以不同的药物剂量和不同的药物作用时间, 确定药物作用靶细胞后与基因表达水平改变之间的量效和时效关系, 然后获取药物在一定浓度、一定时间条件下作用的细胞和未经处理的细胞, 同样条件进行表达谱基因芯片的检测, 最终确定药物所作用的基因靶点, 从而阐明药物作用的机制. 这种研究结果, 对于设计针对此靶点的更为有效的新型药物具有重要的指导意义. 已知膦甲酸钠具有一定的抗HBV的作用, 但其作用机制目前还不是特别清楚. 在临床应用中发现瞵甲酸钠对于机体的免疫调节功能具有一定的影响, 因此我们曾经应用基因表达谱芯片, 对于瞵甲酸钠作用的T淋巴细胞系Jurkat细胞受到瞵甲酸钠的刺激以后, 基因表达谱的改变进行了研究.发现瞵甲酸钠对于Jurkat细胞中一系列基因的表达具有显著的调节作用.这与我们应用抑制性消减杂交技术（SSH）证实膦甲酸钠可以上调Jurkat细胞中胸腺素α等基因的表达的结论是一致的.

另一方面, 肝脏是罹患多种感染性疾病的重要器官, 因此, 针对这些病原体特异性疫苗的研究尤为重要.基因芯片技术的出现和应用, 在新型疫苗的研究中也具有十分重要的应用前景. 以不同的病原体成份进行免疫刺激, 然后以基因芯片技术对于构建的疫苗的免疫应答方式和机制所涉及的靶基因谱进行检测, 从而阐明不同疫苗成份在诱导免疫保护作用中的性质和特点, 以高通量的手段, 解决新型疫苗的候选分子. 这是目前进行新型疫苗研究很有希望的研究手段, 在预防肝脏感染性疾病新型疫苗的研究中具有重要应用前景.

总之, 基因芯片技术作为一种强有力探索未知表达基因的新方法, 可以从总体高度了解二种不同组织表达图谱的变化信息, 为全局理解基因功能和基因之间的相互关系及致病机制提供线索. 而且高通量、自动化的操作更能适应后基因组时代的要求. 在不久的将来, 基因芯片有望进一步阐明病毒性肝炎发生机制和发现新的标志物用于分子诊断. 从长远角度来看, 基因芯片有助于确认病毒感染的肝脏组织的分泌性蛋白基因, 提高血清学诊断水平, 同时也将推动抗病毒治疗的发展.

备注

$[Footnotes]

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