酵母双杂交系统的原理及应用

摘要

N/A

关键词: N/A

N/A

N/A

Correspondence to: N/A

Received: October 29, 2002
Revised: November 10, 2002
Accepted: November 18, 2002
Published online: April 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

蛋白质和蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础. 随着分子生物学技术的发展, 特别是人类基因组计划的完成, 使人类对基因的结构和功能的认识不断加深, 但基因编码的蛋白质的功能研究尚是一个难题. 酵母双杂交 (yeast two hybrid) 技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用, 该方法建立以来, 经过不断的完善和发展, 不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用, 更重要的在于发现新的与已知蛋白相互作用的未知蛋白.

1 酵母双杂交技术的基本思想

酵母双杂交由Fields et al[1]在1989年提出. 他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究. GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域. 位于N端1-174位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNA binding domain, DNA-BD)和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activation domain, AD). DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence, UAS), 并与之结合. 而AD则是通过与转录机构(transcription machinery)中的其他成分之间的结合作用, 以启动UAS下游的基因进行转录. DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应, 但是当二者在空间上充分接近时, 则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子, 使启动子下游基因得到转录.

Fields et al建立了一个双杂交系统, DB与X蛋白融合, AD与Y蛋白融合, 如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物, 使GAL4两个结构域重新构成, 启动特异基因序列的转录. 他们利用Snf1与Snf4的相互作用, 将Snf1与DB融合, Snf4与AD融合, 构建在穿梭质粒上. 其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶, Snf4是他的一个结合蛋白. 研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY: 171菌株, 该菌株含有LacZ报告基因, 并已去除相应转录因子基因. 该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近, 激活了报告基因LacZ的转录. 一般地, 将DB-X的融合蛋白称作诱饵(bait), X往往是已知蛋白, AD-Y称作猎物(prey), 能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因, 通过对报告基因的检测, 反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用.

2 酵母双杂交技术的改进和发展

酵母双杂交系统的出现, 为研究蛋白质之间的相互作用提供了很好的工具, 但这一技术也存在着许多缺陷, 如假阳性和假阴性, 检测敏感度不高, 通过不断的改进, 提高了双杂交系统的灵敏度和特异性. (1)酵母接合型的引入: Bendixen et al [2]通过酵母接合型的引用, 避免了两次转化操作, 同时又提高了双杂交的效率. 在酵母有性生殖过程中涉及到二种配合类型: a接合型和α接合型, 这二种单倍体之间接合能形成二倍体细胞, 根据酵母有性生殖这一特点, 他们将文库质粒转化α接合型酵母细胞, "诱饵"表达载体转化a接合型细胞. 然后分别铺筛选平板使细胞长成菌苔, 再将二种菌苔复印到同一个三重筛选平板上, 只有诱饵和靶蛋白发生了相互作用的二倍体细胞才能在此平板上生长. 单倍体细胞或虽然是二倍体细胞但DB融合蛋白和AD融合蛋白不相互作用的都被淘汰. 阳性克隆则进一步通过β-半乳糖苷酶活力进行鉴定. 这项改进不仅简化了实验操作, 而且也提高了双杂交的筛选效率. Fromont-Racine et al[3]则是把二种细胞直接在滤膜上混合, 然后铺到选择性平板上, 避免了繁琐的复印操作, 使工作效率进一步提高. (2)诱饵表达载体: 常用的有二种, 酵母细胞的GAL4和来自大肠杆菌的LexA, 二者的差别在于LexA不具有核定位序列. (3)猎物表达载体: 酵母GAL4的转录激活域; 来自单纯疱疹病毒的VP16, 其转录活性较高; 来自大肠杆菌的B42转录活性弱, 但可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响. (4)报告基因多样化: 在酵母双杂交系统建立的初期阶段, 由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系, 而这种报告基因的表达往往不能十分严谨地加以控制, 因此容易产生一些假阳性, 灵敏度也不高. 现大多数酵母双杂交系统利用酵母营养缺陷特点引入额外的报告基因, 如广泛采用的HIS3基因. 经过改造的带有HIS3报告基因的酵母细胞, 只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长, HIS3报告基因的转录表达是由"诱饵"和"猎物"的相互作用所启动的. James et al[4]于1996年构建了PJ69-4A菌株, 内含三种不同的报告基因(ADE2、HIS3和LacZ), 分别受三种不同的启动子(GAL2、GALl和GAL7)调控, 而这三种不同的启动子都由GAL4激活, 该菌株可灵敏地检测出很弱的结合作用, 又显著地消除了假阳性.

此后, 研究人员在Fields et al的酵母双杂交原理基础上创建了很多新的方法和系统, 使检测范围扩大, 不仅能检测蛋白的相互作用, 而且还能研究RNA、DNA与蛋白质的相互作用. 下面将感兴趣的几个系统给予介绍.

在酵母双杂交系统中, BD-X与AD-Y在酵母细胞核内发生相互作用, 表达的融合蛋白需定向到核内来激活报告基因的转录, 这就可能限制了大量非核内蛋白质如膜受体蛋白质, 细胞外分泌蛋白质等在此系统中的应用. Aronheim et al [5]将蛋白间相互作用场所从核内转移到酵母细胞膜上进行, 构建了Sos恢复系统(Sos recruitment system, SRS). 基本思想如下: 人的鸟苷酸交换因子(guanyl nucleotide exchange factor, GEF)-Sos蛋白是一种胞质蛋白, 而酵母的鸟苷酸交换因子-cdc25蛋白定位在内膜上, 可将相关受体信号传导给Ras蛋白. 酵母细胞的一种温度敏感菌株-ras途径突变体由于缺乏鸟苷酸交换因子cdc25, 而不能将外来信号传递给膜上的Ras蛋白, 致使该酵母突变体在36 ℃不能存活, 如果人为引入正常的GEF(Sos蛋白), 并且使得GEF能与Ras蛋白足够接近, 则可以弥补这一缺陷. 为此, Aronheim et al将GEF蛋白与蛋白质X融合, 将蛋白质Y与豆蔻酰化信号相连, 使Y定位于膜上. 这样, 若X与Y结合, X连同的蛋白(GEF)就会定位于膜上, 从而得以靠近膜上的Ras蛋白, 激活ras途径, 完成Sos过程, 在36℃生长. 这一系统的提出大大扩展了经典杂合系统的探索领域, 而且冲破了许多的局限. 使一些不基于转录读出的转录激活因子和抑制因子能够利用该技术进行研究, 许多蛋白质在胞质内表达可能比在核内更有生理功能, 一些蛋白的表达对酵母有毒性, 蛋白和Sos融合后毒性则可以减弱. 利用该技术Aronheim et al找到了c-Jun的两个新的作用蛋白JDP1和JDP2.

此后, Hubsman et al[6]构建了RRS系统(reverse ras recruitment system). 将诱饵蛋白定位于膜上, 而猎物"prey"则与胞质中的突变体融合, 从而进一步扩大了应用范围.目前酵母双杂交系统主要还是以酵母细胞核做为相互作用的反应场所, 外源基因的转录、翻译、蛋白产物的修饰、折叠及细胞内定位等过程是在酵母细胞中完成的. 但酵母毕竟是一种低等的真核生物, 他的各种生物学功能, 尤其是蛋白质的翻译后修饰如N端糖基化, 二硫键形成等的水平还很难与高等真核生物相比拟. 因此要进一步研究蛋白质产物的生物学功能, 还必须建立高等生物体系的双杂交系统. 近几年来, 已初步建立了哺乳动物细胞双杂交系统[7,8]. 在此系统中, 采用单纯疱疹病毒的VP16编码区取代GAL4的AD区段, 同时又引入另一个含有氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferanse, CAT)报告基因的表达载体, 其活性可以在细胞提取物中检测, 采用磷酸钙共沉淀法, 转染入HeLa细胞中进行培养. 该系统成功地验证了小鼠p53蛋白与SV40大T抗原间的蛋白质相互作用, 得到了和酵母双杂交技术相同的结果, 在哺乳动物细胞中能更好的模仿体内蛋白-蛋白的相互作用. Rossi et al[9]利用β-半乳糖苷酶构建的杂合体系成功地在成肌细胞中得到表达, 并检测了FRAP与FKBP12二种蛋白质之间的相互作用.

另外, 研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程, 有时还要通过突变、加抑制剂等手段破坏蛋白质间的相互作用. Vidal et al[10]发展了逆双杂交系统(reverse two-hybrid system). 其关键是报告基因URA3的引入. URA3基因编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶. 该酶能把5-氟乳清酸(5-FOA)转化成对细胞有毒的物质. Vidal et al通过改造URA3基因的启动子内引入GAL4的结合位点. 只有当"诱饵"和"猎物"相互作用激活URA3基因的表达时, 这个改造的酵母菌株才能在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上生长. 但在含有5-FOA的完全培养基上, "诱饵"和"猎物"的相互作用则抑制细胞的生长. 然而如果目的蛋白, 即与DB或AD融合的蛋白质发生了突变或者由于外加药物的干扰不再相互作用, URA3基因不表达, 则细胞能在含有5-FOA的完全培养基上生长. 通过这种方法, Vidal et al筛选到了转录因子E2F1的突变物, 这些突变物仍然能结合视网膜母细胞瘤蛋白RB, 但是丧失了同另外一种称为DP1蛋白的结合能力, 结果得到了体外结合实验的验证.通过对这些突变蛋白基因的测序, 他们又发现了新的E2F1同DP1结合的位点.

此外, 酵母单杂交技术研究蛋白质和DNA的相互作用, 小配体三杂交则研究受体与有机小配体之间的作用, RNA三杂交系统则分析RNA与蛋白之间相互作用[11,12].

3 应用

自酵母双杂交系统建立以来, 得到了迅速发展, 成为蛋白质研究工作中有力的工具. 人类基因计划的即将完成, 随之而来的是基因功能的研究, 特别是基因表达蛋白质功能的研究更为重要. 生物体内多种蛋白质的相互作用, 形成复杂的调节网络, 在很大程度上决定细胞内信息系统, 信号转导及细胞周期调节. 已有学者应用酵母双杂交技术对酵母基因组学进行研究[13], 这将为今后大规模的人类基因组学研究探索方法, 积累经验. 另外, 病原体蛋白和机体蛋白质之间的相互作用也是疾病发生、发展的物质基础. 深入研究这些相互作用对于揭示某些疾病如病毒性肝炎、艾滋病等的发病机制, 寻找可能的新的治疗方法有重要意义. 下面仅将这方面的研究工作做一简要介绍.

乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染可引起慢性肝炎、肝硬化、肝肿瘤, 严重危害着人民群众的健康. 但目前致病机制尚未完全阐明, 治疗研究进展缓慢. 病毒蛋白与肝细胞蛋白之间相互作用是病毒致病的关键之一, 通过与肝细胞中的许多蛋白质的相互作用, 介导病毒进入肝细胞, 改变这些蛋白质的活性功能, 进一步调节改变细胞功能, 影响病毒复制, 造成机体免疫功能失调, 慢性化及肿瘤的发生.

目前鉴定的与HBV不同蛋白相互作用的蛋白质有十几种. 其中HBxAg作用复杂, 有反式激活作用, 研究较多. 1995年Fischer et al[14]用酵母双杂交方法, 克隆了与其他生物28 kD亚单位相似的蛋白质序列可以和HBxAg结合. HBxAg结合到特殊的蛋白酶体α亚单位, 干扰其降解过程, 提示HBxAg对转录过程的作用可能是间接的. 而与这个28 kD的蛋白酶体亚单位结合可能提示HBxAg具有多重功能.Hu et al[15]认为HBxAg既是蛋白酶体复合体的底物又是潜在的抑制因子, 他们用酵母双杂交技术等方法证明, HBxAg可以和26 S蛋白酶体的两个亚单位结合. 在HepG2细胞中表达HBxAg降低蛋白酶体的糜蛋白酶及胰酶样活性以及被辅酶Q结合的溶菌酶的水解, 表明了HBxAg可作为蛋白酶体的抑制因子. 这可能是HBV感染的重要特性, 其机制可能是帮助稳定病毒基因产物和抑制抗原提呈. Zhang et al[16]描绘了HBxAg和蛋白酶体相互作用的结构和功能. 用酵母双杂交的方法鉴定了蛋白酶体亚单位PSMA7与HBxAg特异相互作用. 又证实与PSMC1(19S蛋白酶组分的ATPase样亚单位)的相互作用. 与PSMA7和PSMC1相互作用的HBxAg的关键序列对X蛋白作为转录辅助因子功能很重要. PSMC1的过度表达在哺乳动物细胞中似乎抑制各种报告基因的表达, 但可以被HBxAg的过度表达所克服. 另外, HBxAg的表达抑制了细胞中c-Jun和辅酶Q-精氨酸-β-半乳糖苷酶的周转, 这两个是已知的辅酶Q-蛋白酶通路的底物. 研究提示蛋白酶体复合体是HBxAg的细胞靶位的功能基础. Lee et al[17]则证实HBxAg可以和可能的细胞DNA修复蛋白结合. 他们用酵母双杂交技术方法证明一种蛋白(X-associated protein 1, XAP-1)与HBxAg有相互作用, 此蛋白与UV损伤DNA结合蛋白(UV-DDB)同源(来自猴细胞文库), UV-DDB可能涉及DNA修复, X蛋白和此蛋白相互作用可在一定程度上解释乙型肝炎病毒双链的修复以及修饰细胞转录过程, 解释了HBV在肝癌发生过程中起到辅助因子的作用. Barak et al[18]研究了HBxAg和人免疫缺陷病毒(HIV)的Tat结合蛋白1(Tbp1)的相互作用, 应用基于胞质的酵母双杂交筛选鉴定出Tbp1, 一个新的与HBxAg相互作用蛋白. Tbp1在酵母和动物细胞内均和HBxAg有相互作用. HBxAg和Tbp1相互作用具有功能性意义调节HBV转录. Tbp1同源物如Sug1, 是蛋白酶19 S调节帽颗粒的已知成员, 涉及转录共激活. Tbp1和Sug1与多重病毒效应蛋白包括HIV Tat、SV40大T抗原和腺病毒E1A作用, 而这些蛋白是病毒癌基因的重要表位.

Harvey et al[19]为研究HBV受体使用酵母双杂交方法研究L-HBsAg的前S1区筛选人肝文库, 一个未鉴定蛋白和一个线粒体中蛋白可以和前S1相互作用. 起相互作用的两个蛋白用Far-Western及竞争实验分析, 证明这个未鉴定蛋白作用有特异性. 竞争实验表明HBV而不是纯化的HBsAg可以和前S1进行竞争, 阻止谷光甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)-前-S1融合蛋白结合到未鉴定蛋白而不是线粒体蛋白. 这个未鉴定蛋白与GST表达成融合蛋白可以和HBV以直接方式结合, 但不能确定这个蛋白是否是HBV受体.

由此可见HBV与细胞许多蛋白质相互作用, 其中HBxAg作用较广泛, 对细胞的调节, 是通过细胞中许多蛋白质作用而完成的. 对此进行深入研究, 可能为致病机制提供新的线索.

HCV是一个应用分子生物学技术克隆的RNA病毒, 至今无有效的病毒培养系统. 但近年来对病毒的基因及病毒的蛋白有了更多的认识, 通过酵母双杂交等技术, 很多病毒蛋白与细胞蛋白质间的相互作用被确定. HCV核心蛋白与人体作用复杂, 有反式激活细胞基因表达的作用. Matsumoto和Chen et al [20,21]用酵母双杂交技术对人肝cDNA文库进行筛选, 一半以上的克隆都是淋巴毒素b受体(LT-bR)胞质域, 是肿瘤坏死因子受体家族的成员之一. HCV核心蛋白与LT-bR结合, 表明这个蛋白可能有免疫调节功能, 可能部分解释病毒持续感染机制. Chen et al 进一步证实HCV核心蛋白可与LT-bR结合, 在一些细胞中, 核心蛋白通过此通路起到调节作用.他们的发现提示HCV核心蛋白增加LT-bR的生物功能, 引起HCV感染细胞的发病. You et al [22]为了了解HCV核心蛋白的反式激活机制, 克隆了一个cDNA编码DEAD盒家族中推定的RNA解旋酶称为CAP-Rf, HCV核心蛋白的全长成熟形式和C末端截短形式均可以和这个蛋白结合. CAP-Rf所涉及基因表达的调节及 HCV核心蛋白启动CAP-Rf的反式激活能力可能是通过复合体形式和CAP-Rf ATPase-dATPase活性调节. 这些发现表明HCV已经进化了一种特殊机制通过其核壳蛋白涉及RNA代谢, 并提示核心蛋白对宿主细胞的多重作用. 我们通过酵母双杂交技术, 克隆一个HCV核心蛋白结合蛋白(HCBP6), 由456 nt组成, 编码152个氨基酸残基, 位于人22号染色体上, 初步研究表明可能和体内蛋白运输有关.

HCV NS5A是HCV的非结构蛋白之一, 本身是磷酸蛋白, 在病毒复制中可能起作用, 也可能与HCV对干扰素α(IFNα)耐受有一定作用. Ghosh et al[23]用酵母双杂交技术证明了NS5A与新鉴定的细胞转录因子SRCAP相互作用, 可能是NS5A对细胞生长调节的机制之一. Tu et al^［24］认为NS5A是磷酸蛋白具有隐性反式激活作用, 他们用酵母双杂交的方法在人肝文库中筛选出N-己基顺丁烯二酰亚胺(N-ethylmaleimide)敏感因子附着蛋白受体样蛋白, 命名为人囊泡-相关膜蛋白相关蛋白-33(vesicle-associated membrane protein-associated protein, hVAP-33). hVAP-33与NS5A和NS5B的作用部位不同, NS5A结合到hVAP-33的C末端, 而NS5B结合到hVAP-33的N末端, 这些相互作用提示了HCV RNA复制复合体的膜相关机制, 进一步表明NS5A是作为病毒RNA复制复合体的一部分.

王琳et al [25]还发现HCV核心蛋白和NS5A均可和载脂蛋白A1(apoA1)相互作用, 这种结合可能干扰破坏了肝细胞脂类代谢的正常途径, 使肝细胞中脂类代谢机制发生改变, 最终在肝细胞中累积并出现脂肪滴, 形成小泡型、大泡型或大小泡混合型的肝脏脂肪变. Shi et al[26]也通过对HepG2和人肝cDNA文库的酵母双杂交筛选到apoA1, 一个高密度脂蛋白成分, 与NS5A相互作用, 提示NS5A参与脂代谢紊乱的病理过程, 可以解释HCV感染后普遍存在的肝脏脂肪变性.

应用酵母双杂交技术研究HIV蛋白与机体蛋白质之间的相互作用则更为广泛. 艾滋病是由于 HIV感染破坏CD4⁺细胞, 致使机体免疫力下降, 导致各种机会性感染和肿瘤的发生. HIV是目前所发现的调节机制最为复杂的病毒类型之一, 其中包含着复杂的反式调节机制. Kamine et al [27]用人B淋巴文库与HIV-1反式激活因子Tat做酵母双杂交技术筛选, 筛选到一个新的克隆(Tip60)与蛋白的N端功能区域相互作用, 可以使Tat反式激活作用在没有增加HIV启动子基础作用下提高4倍, 提示Tip60可能是Tat的辅助因子, 对HIV基因表达有影响. Tat介导的激活作用需要CycT1/CDK9复合物（P-TEFb）的补充, Fraldi et al[28]通过双杂交及三杂交技术发现了CycT1与CDK9及Tat/TAR特异的结合位点, 这些发现提示可设计一个正确的位点缺失的P-TEFb复合物干扰Tat的功能.

HHR23A是进化的保守基因家族成员, 与核苷酸的删除和修复相关, Withers-Ward et al[29]研究认为与HIV-1的Vpr相互作用, 过量表达HHR23A或切断Vpr结合区, 则使Vpr产生的G2阻止作用减弱. 这些结果提示Vpr干扰蛋白的正常功能或与DNA修复相关的蛋白的正常功能, 干扰了从G2到M周期的信号传递. Gragerov et al[30]的结果也显示HHR23A对Vpr引导的细胞周期停止有减缓作用, 而对Vpr的转录辅助因子功能无影响. Gupta et al[31]通过酵母双杂交技术发现新的HIV颗粒相关与基质相作用的蛋白VAN, 在大多数人组织中表达, 在核和胞质间穿梭, 组织培养中过量表达可以有效地抑制HIV的复制. 结果提示VAN可调节核基质的定位.

尽管越来越多的新的作用蛋白质被发现, 但HBV、HCV、HIV感染的发病机制未完全阐明, 要彻底阐明并完全治疗还有漫长而艰苦的路. 酵母双杂交技术的发展和创新, 使之已成为很多实验室研究蛋白质相互作用和蛋白质结构功能的必要手段. 但是要看到他只是反映蛋白质间可能发生的作用, 还必须通过其他手段来证实, 特别是要和生理病理机制相结合, 才不会被误导.

备注

$[Footnotes]

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