基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-04-15; 11(4): 426-429
在线出版日期: 2003-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i4.426
酵母双杂交技术筛选HBcAg肝细胞结合蛋白基因
陆荫英, 王琳, 成军, 李克, 刘妍, 张玲霞
陆荫英, 王琳, 成军, 李克, 刘妍, 张玲霞, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京 100039
陆荫英, 女, 1973-08-27生, 贵州省贵阳市人, 汉族, 博士生, 主治医师, 主要从事肝病的基础及临床研究.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2002-10-29
修回日期: 2002-11-15
接受日期: 2002-11-28
在线出版日期: 2003-04-15

目的

乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于胞质和胞核中, 对HBV的装配和激发光免疫应答起关键作用, 为研究其具体作用.筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因.

方法

用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因, 连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落, PCR从中扩增出目的片段并测序, 进行生物信息学分析.

结果

成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中表达, 配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长, 并变成蓝色的真阳性菌落16个, 其中含金属硫蛋白A2基因的菌落有2个、未知基因4个、补体8α基因1个、 NAD(P)H脱氢酶亚基1个、维甲酸受体应答元件2基因1个、细胞色素c氧化酶基因1个、细胞色素b基因1个、DAZ相关蛋白2基因2个、线粒体核蛋白L41基因2个、人血白蛋白基因1个.

结论

成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白, 为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.

关键词: N/A
引文著录: 陆荫英, 王琳, 成军, 李克, 刘妍, 张玲霞. 酵母双杂交技术筛选HBcAg肝细胞结合蛋白基因. 世界华人消化杂志 2003; 11(4): 426-429
Screening of HBcAg interacting proteins in hepatocytes with yeast-two hybrid technique
Yin-Ying Lu, Lin Wang, Jun Cheng, Ke Li, Yan Liu, Ling-Xia Zhang
Yin-Ying Lu, Lin Wang, Jun Cheng, Ke Li, Yan Liu, Ling-Xia Zhang, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China
Correspondence to: Jun Cheng, Gene Therapy Research Center, Institute of Infectious Diseases, The 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China. cj@genetherapy.com.cn
Received: October 29, 2002
Revised: November 15, 2002
Accepted: November 28, 2002
Published online: April 15, 2003

AIM

To screen proteins in hepatocytes interacting with hepatitis B virus core protein (HBcAg) with yeast-two hybrid technique for investigating the biological functions of HBcAg.

METHODS

The HBcAg gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and HBcAg bait plasmid was constructed with yeast-two hybrid system 3, then transformed into yeast AH109. The transformed yeast mated with yeast Y187 containing liver cDNA library plasmid in 2×YPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) and synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing X-α-gal for selecting two times and screening. After extracting and sequencing of plasmid from blue colonies, the results were analyzed by bioinformatics.

RESULTS

Sixteen colonies were sequenced, of which, two colonies were metallothionein 2A, one NAD(P)H dehydrogenase, one complement component 8 a polypeptide, one retinoic acid receptor responder (tazarotene induced), one cytochromeb, one cytochrome c oxidase subunit II , one albumin, two DAZ associated protein 2, two mitochondrial ribosomal protein L41 and four new genes with unknown function.

CONCLUSION

Genes of HBcAg interacting proteins in hepatocytes were successfully cloned and the results provided some new clues for studying the biological functions of HBcAg and its associated proteins.

Key Words: N/A
0 引言

在乙型肝炎病毒(HBV)的生活周期中, 病毒核心抗原(HBcAg)、病毒mRNA和DNA聚合酶共同构成核心颗粒, 在核心颗粒中完成病毒DNA的合成[1,2]. HBcAg具有保护病毒mRNA, 防止其被RNA酶降解的作用, 对于乙肝病毒前基因组RNA的装配、基因组DNA的合成具有重要的作用. HBV在肝细胞内复制后, 膜上有HBcAg的表达, HBcAg与HBeAg一同成为细胞毒性T细胞(Tc)细胞识别的主要靶抗原, HBcAg既可作为T细胞依赖性抗原, 也可作为非T细胞依赖性抗原, 诱导强烈CTL应答[3]; B细胞刺突尖部有HBcAg的抗原决定簇, 可产生相应的体液免疫反应[4]. HBcAg在HBV的装配和致病机制中是必不可少的, 利用酵母双杂交技术寻找其与肝细胞中相互作用的蛋白, 并进一步探明具体作用机制, 对于明确HBV致病机制, 有效防治乙型肝炎有着重要意义[5-10].

1 材料和方法
1.1 材料

AH109酵母菌株(MA Ta, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4△, gal80△, LYS2:: GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2URA3:: MEL1TATA-lac Z MEL1)、预转化的cDNA肝文库(Y187)、pGBKT7-BD克隆载体及酵母YPD培养基、SD/-Trp、SD/-Leu, SD/-Trp/-Leu/-His, SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade等培养基、X-α-gal购于Clontech公司. 大肠杆菌DH5α及HBV ayw亚型基因全序列质粒载体pCP10为本室保存, c-myc单克隆抗体本室自制, 由购自ATCC的1-9E10.2杂交瘤产生.辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购于北京中山生物公司. Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、EcoR I和Pst I购于Takara生物公司. 丙烯酰胺、N, N'-亚甲双丙烯酰胺、IPTG及X-β-Gal及pGEM-T载体购于Promega公司.TEMED购于宝林曼公司. 醋酸锂、半硫酸腺苷购于Sigma公司. HBcAg扩增引物(P1 5'GAATTCATGGACATCGACCCTTATAA3', P2 5'CTGCAGAACATTGAGATTCCCGAGAT3'), 肝文库插入序列扩增引物(P3 5'-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3', P4 5'-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGA-3')合成及DNA测序由上海博亚公司承担.

1.2 方法

(1)诱饵质粒的构建及表达: PCR扩增HBcAg基因与pGBK-T7载体连接, 酶切鉴定后转化入酵母菌株AH109, 提取酵母蛋白质用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹法验证HBcAg在酵母中的表达. (2)诱饵与肝文库的酵母配合: 挑取在SD/-Trp培养基上生长的pGBKT7-HBcAg质粒的酵母AH109菌落一到数个接种于SD/-Trp培养基中, 30 ℃ 250 r.min-1振摇过夜, 次日离心后用2×YPDA培养液5 ml重悬细胞, 计数细胞数> 1×1012.L-1时与1 ml的肝文库酵母细胞在50 ml 2×YPDA中30 ℃ 30-50 r.min-1配合18-24 h, 离心用1×YPDA 10 ml重悬细胞, 分别取250 ml铺于15 cm的SD/-Trp/-Leu/-His(3缺), SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade (4缺)培养基各25块上, 同时将配合产物按1:10、1:100、1:1000铺于SD/-Trp/-Leu培养基上检验配合效率. 生长6-18 d后挑取大于直径3 mm的菌落再次画线于铺有X-α-gal的4缺培养基上检查X-α-gal酶活性, 在此培养基上能生长且变成蓝色的为真阳性菌落. PCR扩增出文库靶基因片段后测序并进行生物信息学分析.

2 结果
2.1 pGBKT7-HBcAg重组诱饵质粒的构建及表达

利用自行设计的引物P1\P2成功扩增出HBcAg基因片段, PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约549 bp, 与预期片段符合, 且无非特异扩增现象, 测序结果显示完全符合报告序列. 用EcoRI及PstI双酶切所得片段, 连接到用相同酶所切的pGBKT7载体中, 经酶切鉴定结果正确(图1). 由此表明HBcAg基因已按正确方向克隆入酵母表达载体pGBKT7中, pGBKT7-HBcAg质粒构建成功. 用醋酸锂法将诱饵质粒转化入酵母AH109株后在SD/-Trp培养基上筛选生长6-8 d, 挑取阳性菌落培养后提酵母蛋白质, 进行SDS-PAGE和Western免疫印迹分析结果(图2). 结果显示对照无表达而转化了pGBKT7-HBcAg的酵母蛋白提取物Western印迹分析可见明显目的条带且无杂带, 说明HBcAg基因已成功地在酵母中表达.

图1
图1 pGBKT7-HBcAg质粒EcoR I和Pst I酶切. 1: 3 DNA Marker; 2: pGBKT7-HBcAg.
图2
图2 pGBKT7-HBcAg酵母细胞表达Western免疫印迹分析. 1: 5 ul上样; 2: 10 ul上样.
2.2 诱饵与肝文库酵母菌株配合结果

配合后筛选出既能在在4缺( SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的4缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落16个, 用文库扩增引物PCR扩增出目的片段(图3)并测序, 结果在GeneBank中进行分析, 发现其中含金属硫蛋白2A基因的菌落有2个, 补体8α基因1个, NAD(P)H脱氢酶亚基1个、维甲酸受体应答元件2基因1个、细胞色素c氧化酶基因1个、细胞色素b基因1个、DAZ相关蛋白2基因2个、线粒体核蛋白L41基因2个、人血白蛋白基因1个, 未知基因4个, 见表1.

表1 HBcAg肝文库筛选结果.
同源蛋白质同源性相同克隆数
维甲酸受体应答元件2100 %1
补体8A98 %1
金属硫蛋白2A100 %2
细胞色素B100 %1
未知蛋白98 %4
线粒体核蛋白L41100 %2
DAZ相关蛋白2100 %2
细胞色素C氧化酶99 %1
人血白蛋白100 %1
NADH脱氢酶亚基4100 %1
图3
图3 部分文库筛选菌落PCR扩增结果.
3 讨论

酵母双杂交系统是近年来新发展起来的一种分析真核细胞中蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA相互作用的一种有效的基因分析方法, 他的产生为研究蛋白在体内生理情况下相互作用提供了遗传学方法. 酵母双杂交系统通过将两个推定相互作用的蛋白X和Y被分别融合到一酵母转录激活因子GAL4的BD和AD上, X与Y的相互作用重构了激活因子导致下游报告基因的转录, 产生容易探测到的表型.我们选用的Clontech公司的酵母双杂交系统-3, 在下游有3种报告基因分别为组氨酸、腺苷和半乳糖苷酶(LacZ), 加上两种载体中分别带有的亮氨酸、色氨酸, 使得真阳性菌落能在铺有X-α-gal并缺乏上述4种营养的培养板上生长并呈现出蓝色. 由于增加了报告基因的种类, 使单个报告基因自激活出现假阳性的几率大大降低, 筛选结果的真阳性率可达95%[11-15].

HBcAg有保守的三维结构, 受细胞激酶或病毒编码的激酶作用部分磷酸化[16], HBcAg有鱼精蛋白样亲胞核性的羧基末端, 可介导核内转运信号, 使大量HBcAg进入细胞核内, 而其他嗜肝DNA病毒的核壳蛋白都不核内转运, 人肝细胞核内HBcAg的功能不明. 在病毒成熟过程中, 核壳和外膜相互作用, 形成病毒颗粒分泌的信号[17,18]. HBcAg有高免疫原性, 几乎所有HBV感染者均产生抗HBc, 同时是CTL免疫应答的靶抗原, 对于HBcAg的免疫应答在病毒清除中可能有重要作用. HBcAg与肝细胞蛋白的相互作用是病毒装配、释放、清除过程中关键的环节, 找出其间的联系对于探明HBV致病机制, 寻找有效的防治方法有着深远意义[19-26].

我们利用酵母双杂交系统了技术, 在真核表达载体pGBKT7中构建pGBKT7-HBcAg诱饵质粒并在酵母菌株AH109中表达了HBcAg基因, 与人肝cDNA文库的酵母菌株Y187进行配合, 筛选出与之相互作用的蛋白基因16种. 其中, 金属硫蛋白系存在于人体及哺乳动物肝内的一种富含金属和半胱氨酸的小分子蛋白质, 在体内具有拮抗重金属(隔、汞和铝)和抗辐射(包括紫外线), 消除自由基、修复受损组织等功效, 他还能为生物体提供多种微量元素(如锌、铜、钴等), 与HBcAg结合可能是机体自身保护反应的一种, 是否可以用他作为抗HBV的辅助用药[27-29]. 临床上HBV的感染者中, 男性发生慢性化、重症化及肝硬化的几率远大于女性, 曾有人提出可能跟雌激素作用有关, 但未找到确切的证据, HBV感染发展的性别差异的原因至今仍是个未知数. 位于Y染色体上的DAZ基因和位于常染色体上的DAZ类似基因DAZL1, 编码一种只在精子细胞中表达的RNA结合蛋白, 他们与果蝇属♂不育基因同源, 在DAZL1敲除的鼠发生不育, 说明DAZ基因在精子发生过程中起作用. 所有的哺乳动物常染色体都有DAZL1的同源基因, 而DAZ基因只存在于猿和部分种类的猴中, 二者的C-末端重复序列有所不同. 有人用DAZ做诱饵, 酵母双杂交技术筛选获得与之有相互作用但功能未知的DAZ相关蛋白2(DAZAP2), 我们用HBcAg在肝文库中也筛选到该蛋白, 并有两个克隆, 提示HBV感染发生、发展的性别差异可能与之有关系[30-32]. HBcAg与线粒体核蛋白L41、NADH脱氢酶亚基4、细胞色素C氧化酶、细胞色素B等有作用, 支持HBcAg通过肝细胞线粒体介导HBV的复制和装配. 新基因的发现也为我们研究HBcAg的功能提出了新线索, 但需要进一步研究证实.

1.  Pumpens P, Grens E. Hepatitis B core particles as a universal display model: a structure-function basis for development. FEBS Lett. 1999;442:1-6.  [PubMed]  [DOI]
2.  Le S, Pogam S, Shih C. Influence of a putative intermolecular interaction between core and the Pre-S1 domain of the large envelope protein on hepatitis B virus. J Virol. 2002;76:6510-6517.  [PubMed]  [DOI]
3.  Livingston BD, Crimi C, Fikes J, Chesnut RW, Sidney J, Sette A. Immunization with the HBV core 18-27 epitope elicits CTL responses in humans expressing different HLA-A2 supertype molecules. Hum Immunol. 1999;60:1013-1017.  [PubMed]  [DOI]
4.  Lazdina U, Cao T, Steinbergs J, Alheim M, Pumpens P, Peterson DL, Milich DR, Leroux-Roels G, Sallberg M. Molecular basis for the interaction of the hepatitis B virus core antigen with the surface immunoglobulin receptor on naive B cells. J Virol. 2001;75:6367-6374.  [PubMed]  [DOI]
5.  Lu YY, Li K, Cheng J, Wang L, Liu Y, Duan HJ, Zhang LX. Cloning and expression of hepatitis B virus X gene in yeast. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:15-18.  [PubMed]  [DOI]
6.  Wang L, LiK , Cheng J, Lu YY, Wang G, Liu Y, Duan HJ, Hong Y. Screening and cloning of the genes of protein interacting with human augmenter of liver regeneration. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:161-164.  [PubMed]  [DOI]
7.  Li K, Wang L, Cheng J, Zhang LX, Duan HJ, Lu YY, Yang JZ, Liu Y, Hong Y, Xia XB. Screening and cloning of gene of hepatocyte protein 1 interaction with HCV core proyein. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2001;9:1379-1383.  [PubMed]  [DOI]
8.  Li K, Wang L, Cheng J, Lu YY, Zhang LX, Liu Y, Duan HJ. Expression of NS2 gene of hepatitis C virus from yaest two hybrid 'bait'vector in yeast. Sjijie Huaren Xiaohua Zazhi. 2002;10:129-132.  [PubMed]  [DOI]
9.  Li K, Wang L, Cheng J, Lu YY, Zhang LX, Mu JS, Liu Y, Duan HJ, Wang G, Li L. Mutunal interaction between hepatitis C virus core protein and translin, a recombination hotspot bingding protein. Zhonghua Yixue Zazhi. 2002;82:1-5.  [PubMed]  [DOI]
10.  Lu YY, Li K, Cheng J, Wang L, Liu Y, Zhang LX. Cloning and expression of pre -s1 gene of hepatitis B virus in yeast. Jiefangjun Yixue Zazhi. 2002;27:341-342.  [PubMed]  [DOI]
11.  Wang XZ, Jiang XR, Chen XC, Chen ZX, Li D, Lin JY, Tao QM. Seek protein which can interact with hepatitis B virus X protein from human liver cDNA library by yeast two-hybrid system. World J Gastroenterol. 2002;8:95-98.  [PubMed]  [DOI]
12.  Nagpal S, Ghosn CR, Chandraratna RA. Identification of nuclear receptor interacting proteins using yeast two-hybrid technology. Methods Mol Biol. 2001;176:359-376.  [PubMed]  [DOI]
13.  Serebriiskii IG, Toby GG, Finley RL Jr, Golemis EA. Related Articles Genomic analysis utilizing the yeast two-hybrid system. Methods Mol Biol. 2001;175:415-454.  [PubMed]  [DOI]
14.  Gietz RD, Woods RA. Screening for protein-protein interactions in the yeast two-hybrid system. Methods Mol Biol. 2002;185:471-486.  [PubMed]  [DOI]
15.  Zhen Z. Progress in proteomics. Shengwu Gongcheng Xuebao. 2001;17:491-493.  [PubMed]  [DOI]
16.  Kann M, Sodeik B, Vlachou A, Gerlich WH, Helenius A. Phosphorylation-dependent binding of hepatitis B virus core particles to the nuclear pore complex. J Cell Biol. 1999;145:45-55.  [PubMed]  [DOI]
17.  Watts NR, Conway JF, Cheng N, Stahl SJ, Belnap DM, Steven AC, Wingfield PT. The morphogenic linker peptide of HBV capsid protein forms a mobile array on the interior surface. EMBO J. 2002;21:876-884.  [PubMed]  [DOI]
18.  Karpenko LI, Ivanisenko VA, Pika IA, Chikaev NA, Eroshkin AM, Veremeiko TA, Ilyichev AA. Insertion of foreign epitopes in HBcAg: how to make the chimeric particle assemble. Amino Acids. 2000;18:329-337.  [PubMed]  [DOI]
19.  Huang CJ, Chen YH, Ting LP. Hepatitis B virus core protein interacts with the C-terminal region of actin-binding protein. J Biomed Sci. 2000;7:160-168.  [PubMed]  [DOI]
20.  Fehr T, Skrastina D, Pumpens P, Zinkernagel RM. T cell-independent type I antibody response against B cell epitopes expressed repetitively on recombinant virus particles. Proc Natl Acad Sci USA. 1998;95:9477-9481.  [PubMed]  [DOI]
21.  Sijts AJ, Ruppert T, Rehermann B, Schmidt M, Koszinowski U, Kloetzel PM. Efficient generation of a hepatitis B virus cytotoxic T lymphocyte epitope requires the structural features of immunoproteasomes. J Exp Med. 2000;191:503-514.  [PubMed]  [DOI]
22.  Pumpens P, Grens E. HBV core particles as a carrier for B cell/T cell epitopes. Intervirology. 2001;44:98-114.  [PubMed]  [DOI]
23.  Tsai SL. Immunopathogenesis of viral hepatitis B and C. Changgeng Yixue Zazhi. 1999;22:159-170.  [PubMed]  [DOI]
24.  Ulrich R, Koletzki D, Lachmann S, Lundkvist A, Zankl A, Kazaks A, Kurth A, Gelderblom HR, Borisova G, Meisel H. New chimaeric hepatitis B virus core particles carrying hantavirus (serotype Puumala) epitopes: immunogenicity and protection against virus challenge. J Biotechnol. 1999;73:141-153.  [PubMed]  [DOI]
25.  Murray K, Shiau AL. The core antigen of hepatitis B virus as a carrier for immunogenic peptides. Biol Chem. 1999;380:277-283.  [PubMed]  [DOI]
26.  Cao T, Meuleman P, Desombere I, Sallberg M, Leroux-Roels G. In vivo inhibition of anti-hepatitis B virus core antigen (HBcAg) immunoglobulin G production by HBcAg-specific CD4(+) Th1-type T-cell clones in a hu-PBL-NOD/SCID mouse model. J Virol. 2001;75:11449-11456.  [PubMed]  [DOI]
27.  Quaife CJ, Cherne RL, Newcomb TG. Metallothionein overexpression suppresses hepatic hyperplasia induced by hepatitis B surface antigen. Toxicol Appl Pharmacol. 1999;155:107-116.  [PubMed]  [DOI]
28.  Okazaki Y, Namikawa K, Minami T. Studies of metals and metallothionein in tissue. Yakugaku Zasshi. 2000;120:282-289.  [PubMed]  [DOI]
29.  Smolarek C, Stremmel W. Therapy of wilson disease. Z Gastroenterol. 1999;37:293-300.  [PubMed]  [DOI]
30.  Brekhman V, Itskovitz-Eldor J, Yodko E, Deutsch M, Seligman J. The DAZL1 gene is expressed in human male and female embryonic gonads before meiosis. Mol Hum Reprod. 2000;6:465-468.  [PubMed]  [DOI]
31.  Tsui S, Dai T, Roettger S, Schempp W, Salido EC, Yen PH. Identification of two novel proteins that interact with germ-cell-specific RNA-binding proteins DAZ and DAZL1. Genomics. 2000;65:266-273.  [PubMed]  [DOI]
32.  Dorfman DM, Genest DR, Reijo Pera RA. Human DAZL1 encodes a candidate fertility factor in women that localizes to the prenatal and postnatal germ cells. Hum Reprod. 1999;14:2531-2536.  [PubMed]  [DOI]