大肠癌 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-03-15; 11(3): 298-301
在线出版日期: 2003-03-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i3.298
TRAIL对结肠癌细胞株SW480的细胞毒作用
李小安, 房殿春, 杨柳芹, 张汝刚, 司佩任
李小安, 房殿春, 杨柳芹, 张汝刚, 司佩任, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化专科中心 重庆市 400038
李小安, 男, 1968年生, 安徽省东至县人, 汉族, 2001年第三军医大学博士研究生毕业, 现为成都军区总医院主治医师, 主要从事消化系疾病诊治研究.
基金项目: 全军"十五"科研基金资助课题, No. 01MA172.
通讯作者: 房殿春, 400038, 重庆市, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化专科中心. fangdianchun@hotmail.com
电话: 023-68754124 传真: 023-68754124
收稿日期: 2002-07-31
修回日期: 2002-08-03
接受日期: 2002-08-16
在线出版日期: 2003-03-15

目的: 观察TRAIL对结肠癌细胞株SW480的细胞毒作用.

方法: 采用MTT法检测TRAIL对结肠癌SW480细胞存活分数的影响; TUNEL法检测TRAIL对结肠癌SW480细胞凋亡率的影响.

结果: TRAIL能有效地杀伤结肠癌SW480细胞, MTT法显示1 000 μg/L的TRAIL作用24 h SW480细胞存活分数仅为18.7%. TUNEL法均显示0, 50, 150, 500, 1 500, 5 000 μg/L TRAIL蛋白诱导结肠癌SW480细胞的凋亡率分别为6.7%, 29.4%, 42.8%, 50.8%, 84.6%和87.4%; 500 μg/L TRAIL蛋白于0, 6, 12, 18, 24和30 h诱导结肠癌SW480细胞的凋亡率分别为7.8%, 21.4%, 41.8%, 60.6%, 73.8%和77.3%. TRAIL对结肠癌SW480细胞的作用存在较好的量效关系和时效关系.

结论: TRAIL能通过诱导细胞凋亡的方式杀伤SW480细胞, 有可能成为有效的抗结肠癌新药.

关键词: N/A
引文著录: 李小安, 房殿春, 杨柳芹, 张汝刚, 司佩任. TRAIL对结肠癌细胞株SW480的细胞毒作用. 世界华人消化杂志 2003; 11(3): 298-301
Cytotoxicity of TRAIL on colon cancer cell line SW480
Xiao-An Li, Dian-Chun Fang, Liu-Qin Yang, Ru-Gang Zhang, Pei-Ren Si
Xiao-An Li, Dian-Chun Fang, Liu-Qin Yang, Ru-Gang Zhang, Pei-Ren Si, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China
Correspondence to: Dian-Chun Fang, Department of Gastroenterology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China. fangdianchun@hotmail.com
Received: July 31, 2002
Revised: August 3, 2002
Accepted: August 16, 2002
Published online: March 15, 2003

AIM: To study cytotoxic effect of TRAIL on colon cancer cell line SW480.

METHODS: The viability of SW480 cells was measured by MTT assay and the apoptotic rate was determined by TUNEL method.

RESULTS: Results of TUNEL and MTT assay showed that TRAIL had high antitumor activity in a time- and concentration-dependent manner. Survival rate of SW480 cells after TRAIL(1 000 μg/L) treatment was 18.7%. The apoptotic rates of SW480 cells after exposure TRAIL at concentration of 0, 50, 150, 500, 1 500 and 5 000 μg/L were 6.7%, 29.4%, 42.8%, 50.8%, 84.6% and 87.4%, respectively. The apoptotic rates of SW480 cells after treatment with 500 μg/L TRAIL for 0, 6, 12, 18, 24 and 30 hours were 7.8%, 21.4%, 41.8%, 60.6%, 73.8% and 77.3%, respectively.

CONCLUSION: The results demonstrate that TRAIL can induce apoptosis and destruction of SW480 cells, and is a potential new cytotoxic drug in cancer therapy.

Key Words: N/A
0 引言

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)是TNF家族的新成员, 其基因是Wiley小组于1995年克隆和命名的. 与TNF和FasL不同, TRAIL仅诱导被病毒感染的细胞、转化细胞和肿瘤细胞的凋亡, 而对正常细胞几乎无杀伤作用[1-4]. 目前大肠癌的治疗仍以手术切除为首选[5,6], 晚期的疗效仍不理想, 因此探索新的有效的治疗手段已成为大肠癌研究领域的热点之一[7-13], TRAIL独特的生物学特点给肿瘤治疗带来了新的希望. 我们在国内较早地利用大肠杆菌表达、并成功分离纯化出有活性的可溶性TRAIL蛋白(氨基酸114-281, 带六聚组氨酸尾)[14]. 现进一步研究TRAIL对结肠癌细胞株SW480的细胞毒作用, 希图为TRAIL的临床应用提供实验依据.

1 材料和方法
1.1 材料

可溶性TRAIL蛋白(氨基酸114-281, 带六聚组氨酸尾)由本实验室制备; MTT购自上海生物工程技术公司; TUNEL原位凋亡检测试剂盒购自罗氏公司; RPMI 1640培养基购自Sigma公司; 结肠癌细胞株SW480由本实验室保种. SW480细胞培养于含100 mL/L灭活的小牛血清、100 KU/L青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液中, 培养条件为37℃ 50mL/L饱和湿度, 每2-3 d用2.5 g/L胰酶消化, 以1:3-1:5传代.

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测TRAIL对结肠癌SW480细胞存活分数的影响: TRAIL对SW480细胞存活分数的量效关系按10、30、100、300、1 000、3 000 μg/L给予TRAIL, 同时设对照, 18 h后测值[4]; TRAIL对SW480细胞存活分数的时效关系按每孔加TRAIL 1 000 μg/L, 取孵育0、6、12、18、24、30 h细胞分别测值, 每个时段均设对照. 细胞长至对数生长期时, 以2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞, 用含50 μL/L小牛血清的RPMI 1640配成单个细胞悬液, 按每孔3×103个细胞接种于96孔板, 每孔终体积为200 μL, CO2孵育箱内培养2-3 d后加上述各组药物. 测值4 h前每孔加5 g/L浓度的MTT 20 μL, 孵育后吸去孔内上清, 每孔加150 μL DMSO, 振荡10 min, 酶联免疫检测仪测A570值. 细胞存活分数(survival fraction) = 实验组A570/对照组A570×100%.

1.2.2 TUNEL法检测TRAIL对SW480细胞凋亡率的影响: TRAIL对SW480凋亡率的量效关系按0、50、150、500、1 500、5 000 μg/L的剂量给予TRAIL, 18 h后测凋亡率; TRAIL对SW480细胞凋亡率的时效关系按每孔加TRAIL1 000 μg/L, 取孵育0、6、12、18、24、30 h细胞分别测凋亡率. 将无菌的盖玻片置于6孔板中, 每孔1片. 取对数生长期细胞以2.5 g/L胰蛋白酶消化细胞, 用100 mL/L小牛血清的RPMI 1640配成单个细胞悬液, 稀释成5×108/L, 取0.5 mL滴于盖玻片上, 37℃, 50 mL/L CO2, 饱和湿度下孵育2 h后, 每孔加培养液2 mL, 培养1 d后, 每孔加入上述浓度的药物. TUNEL法检测细胞凋亡率按TUNEL试剂盒说明操作, DAB显色后, 高倍镜(400×)下随机数200个细胞, 共数5个视野, 记下凋亡细胞数和未凋亡细胞数. 细胞凋亡率(apoptosis rate) = 凋亡细胞数/(凋亡细胞数+未凋亡细胞数)×100%.

2 结果
2.1 TRAIL对结肠癌SW480细胞存活分数的影响

不同剂量的TRAIL与结肠癌SW480细胞共同孵育18 h后, 细胞存活分数从10 μg/L的98.8%下降至3 000 μg/L的16.0%, 其量效关系曲线近似标准的"S"形, 近似直线部分位于100-1 000 μg/L之间(图1). 1 000 μg/L的TRAIL作用于细胞, 细胞的存活分数随时间的延长而减少, 从6 h的65.3%到30 h的16.6%. 1 000 μg/L的TRAIL作用24 h即达到满意的效果, 其存活分数为18.7%(图2).

图1
图1 TRAIL对结肠癌细胞SW480存活分数的量效关系.
图2
图2 TRAIL对结肠癌SW480细胞存活分数的时效关系.
2.2 TRAIL对结肠癌SW480细胞凋亡率的影响

0, 50, 150, 500, 1 500, 5 000 μg/L TRAIL蛋白诱导结肠癌SW480细胞的凋亡率分别为6.7%, 29.4%, 42.8%, 50.8%, 84.6%和87.4%, 显示有较好的量效关系(图3). 采用500 mg/L TRAIL蛋白于0, 6, 12, 18, 24和30 h诱导结肠癌SW480细胞的凋亡率分别为7.8%, 21.4%, 41.8%, 60.6%, 73.8%和77.3%, 显示有效好的时效关系(图4).

图3
图3 TRAIL对结肠癌SW480细胞凋亡率的量效关系.
图4
图4 TRAIL对结肠癌SW480细胞凋亡率的时效关系.
3 讨论

与TNF家族的其他成员TNF或Fas不同, TRAIL能选择性地杀死肿瘤细胞, 而对正常细胞的影响很小[15-17], 目前国外认为TRAIL极有可能成为新一代的抗肿瘤药物. 我们在国内较早地完成了可溶性TRAIL(氨基酸114-281, 带六聚组氨酸尾)的表达、分离纯化和鉴定工作[14], 在此基础上我们研究了TRAIL对结肠癌SW480细胞的作用. MTT的结果表明, TRAIL对结肠癌SW480细胞存活分数存在较好的量效关系和时效关系. 不同剂量的TRAIL与结肠癌SW480细胞共同孵育18 h后, 细胞存活分数从10 μg/L的98.8%降至3 000 μg/L的16.9%; 1 000 μg/L的TRAIL作用于细胞, 细胞的存活分数随时间的延长而减少, 从6 h的65.3%下降到30 h的16.6%. 以上结果表明, 较小剂量的TRAIL在很短的时间内对SW480细胞有强烈的杀伤作用. TUNEL法表明TRAIL诱导的SW480细胞凋亡也具有很好的量效和时效关系, 进一步证明了TRAIL对SW480细胞的杀伤作用. TUNEL法是检测凋亡的经典方法, 在本文中, 该方法得到的结果与MTT法的结果基本一致, 因此可以认为, TRAIL是通过诱导细胞凋亡的方式杀伤SW480细胞的[18-23].

TRAIL 诱导细胞凋亡的机制尚未完全明了. 研究表明, 其主要通过两条途径调控细胞凋亡, 亦即caspase途径[24-27]和NF-kB途径[28]. TRAIL有5种受体, 即DR4, DR5, DcR1, DcR2和OPG. TRAIL通过与DR4和DR5结合诱导肿瘤细胞凋亡, 但与DcR1、DcR2和OPG结合并不能诱导细胞凋亡[29], DcR1和DcR2受体启动子的高甲基化可下调其在神经母细胞中的表达[30]. 尽管本文的结果表明TRAIL可以诱导SW480细胞凋亡, 但TRAIL受体在SW480细胞中的表达如何及TRAIL通过那条途径诱导细胞凋亡尚需进一步研究.

尽管最近发现正常人的肝、肾和关节软骨细胞对TRAIL也很敏感[31-33], 有可能给TRAIL的临床应用带来障碍. 但最近Ozoren et al[34]发现caspase-9的抑制剂Z-LEHD-FMK可以保护正常人的肝细胞, 而不影响TRAIL对一些肿瘤细胞的杀伤作用. 近年国外关于TRAIL抗肿瘤方面的文章也几乎成倍增长, TRAIL依然被认为有可能成为最有效的抗肿瘤药物. 因此, 我们的研究为TRAIL将来应用于结肠癌的治疗提供了实验基础.

编辑: N/A

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