基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-02-15; 11(2): 219-223
在线出版日期: 2003-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i2.219
小鼠骨髓树突状细胞改良培养及体外生物学特性的比较
王全楚, 冯志华, 周永兴, 聂青和, 郝春秋, 王九平
王全楚, 冯志华, 周永兴, 聂青和, 郝春秋, 王九平, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
王全楚, 男, 1966-11-13生, 湖北省云梦县人, 汉族, 主治医师, 博士研究生. 1990年第一军医大学军医系本科毕业, 1997硕士, 2001年始在导师周永兴教授指导下从事病毒性肝炎基因治疗的研究, 共发表论文30篇, 参加编写医学专著9部.
基金项目: 国家自然科学基金课题, No. 30170822.
通讯作者: 冯志华, 710038, 陕西省西安市, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心. quanchuwang998@hotmail.com
电话: 029-3577595
收稿日期: 2002-10-25
修回日期: 2002-11-02
接受日期: 2002-11-19
在线出版日期: 2003-02-15

目的: 探讨小鼠骨髓树突状细胞体外生物学特性及用自体腹膜培养基代替细胞因子刺激树突状细胞体外生长的可能性.

方法: 无菌取小鼠的骨髓分离、 培养DC前体, 分别以小鼠腹膜分泌液和重组细胞因子mGM-CSF, mIL-4刺激培养使DC前体转化为DC, 再用混合淋巴细胞增生反应(MLR)、细胞免疫组织化学染色及光镜、扫描电镜观察二种DC生物特性及免疫活性的差异.

结果: 培养6-8 d, 二种方法培养的骨髓DC (BM-DC)均有大 量细胞从集落中释放, 并呈成熟状态, 重组mGM-CSF, mIL-4刺激培养的DC得率稍高(6×106)于腹膜培养组(3×106), 但无显著性差异; 培养7 d BM-DC的B7-2表达较高, 呈强阳性, 混合淋巴细胞反应(MLR)中均表现出有强烈刺激同种T 细胞增生的能力; 尤以重组mGM-CSF, mIL-4组明显高于腹膜培养组, 未加任何处理的空白对照组中 DC前体具有非成熟 DC 的形态及功能特征, 且无刺激 同种T 细胞增生的能力.

结论: 实验结果提示用自体腹膜培养基代替细胞因子刺激树突状细胞体外生长可获得一定数量的树突状细胞并具有相应的生物学特性及功能, 基本能满足实验研究的需要, 为基层单位开展树突状细胞的研究提供了可能性.

关键词: N/A

引文著录: 王全楚, 冯志华, 周永兴, 聂青和, 郝春秋, 王九平. 小鼠骨髓树突状细胞改良培养及体外生物学特性的比较. 世界华人消化杂志 2003; 11(2): 219-223
Comparative research of dendritic cells cultured from mice bone marrow with different ways
Quan-Chu Wang, Zhi-Hua Feng, Yong-Xing Zhou, Qing-He Nie, Chu-Qiou Hao, Jiou-Ping Wang
Quan-Chu Wang, Zhi-Hua Feng, Qing-He Nie, Chu-Qiou Hao, Jiou-Ping Wang, Rong-Xing Zhou, The Center of Diagnosis and Treatment of Infection Diseases of PLA, Affiliated Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 39800122.
Correspondence to: Zhi-Hua Feng, The Center of Diagnosis and Treatment of infection diseases of PLA, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China. quanchuwang998@hotmail.com
Received: October 25, 2002
Revised: November 2, 2002
Accepted: November 19, 2002
Published online: February 15, 2003

AIM: To compare the biological characteristics of cultured mice bone marrow dendritic cell (BM-DC) in cultural media with peritoneum or with growth stimulating factor.

METHODS: DC progenitors of were isolated from bone marrow of Balb/C mice, and transformed into DC cell by culturing with secretary fluid of peritoneum, mGM-CSF, and mIL-4, respectively. The biological features and immunity of the DC cells were studied with mixed lymphocyte reaction, immunohistochemistry staining, light microscope and scanning electronic microscope.

RESULTS: After culturing for 6-8 days, the number of BM-DC (6x106) released from proliferating colony in media containing mGM-CSF and mIL-4 was higher than that in media containing peritoneum without significant difference. High level of expressed CD86 on BM-DC was demonstrated on day 7 in culture, MLR results indicated that the stimulating ability for proliferation of T cell was higher in media with mGM-CSF, mIL-4 than that with peritoneum, while the control media without stimulating factors showed no ability to stimulate the growth of T cells

CONCLUSION: These observations demonstrated that auto-peritoneum can substitute for cytokines in media and stimulate the growth of bone marrow-derived DCs, which possess the corresponding cellular biological features and cellular immunity.

Key Words: N/A


0 引言

树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前发现的功能最强的专职抗原递呈细胞, 在免疫反应中起着举足轻重的作用, 因此备受重视[1,2]. 1990年以来, 人们在体外诱导扩增DC成功之后, 克服了以往由于DC在组织中含量很少、难以获取的困难, 使DC研究取得了许多突破性的进展, 为人们探索新的疾病防治手段开辟了新的天地[3-11]. 体外诱生DC有许多不同的方案. 骨髓、脐血和外周血干细胞、外周血单核细胞, 都可以作为前体来诱导分化为DC, 尽管用不同的前体细胞扩增DC的方法各不相同, 但GM-CSF似乎是必不可少的[12-22]. IL-4往往与GM-CSF同时使用, 特别是将外周血单个核细胞或单核细胞作为前体时. 但重组细胞因子存在价格昂贵保存时间短等缺点, 我们根据小鼠自体腹膜可以分泌GM-CSF的特点, 用腹膜分泌液培养基代替细胞因子刺激树突状细胞体外生长的可能性. 那么这两种细胞的生物特性之间存在什么样的差异?为此, 我们将相同来源的DC在不同条件下进行体外培养[23-28], 对二种 DC 的生长发育、生物学特征及免疫学功能进行初步探讨.

1 材料和方法
1.1 材料

8-10 wk Balb/c 小鼠(H-2 Kd), 购自第四军医大学实验动物中心. 红细胞裂解液(139.6 mmol/L NH4Cl, 16.96 mmol/L Tris, 用1 mol/L HCl调 pH至7.2)本室配制; GNK缓冲液(8 g/L NaCl, 0.4 g/LKCl, 1.77 g/L Na2HPO4.2H2O, 0.6 g/L NaH2PO4.H2O, 0.2 g/L葡萄糖, 0.01 g/L酚红)本室配制, 这两种缓冲液均高压灭菌, 4℃ 保存. RPMI 1 640 完全培养基: 由 RPMI 1 640 干粉 10.4 g/L(购自 GIBCO公司), HEPES 2×10-2 mol/L、L-谷氨酰胺2×10-3 mol/L、2-巯基乙醇0.05 mol/L、非必需氨基酸0.1 mol/L、丙铜酸钠1 mol/L、双抗(青霉素100 K U/L、链霉素0.1 g/L)和100 mL/L灭活的胎牛血清(购自GIBCO 公司)构成. 鼠重组 GM-CSF(mrGM-CSF)为 GIBCOL 公司产品, MTT试剂为华美生物技术公司产品. 大鼠抗小鼠 H-2b, I-Ab, B7-2等单抗、羊抗大鼠二抗及 FITC标记的羊抗大鼠二抗购自Pharmingen 公司. 腹膜培养基的制备: Balb/c♀小鼠10只, 颈椎脱臼处死, 无菌取腹膜4×5 cm大小用 Hanks 液冲洗3次, 接种于加有RPMI 1 640 完全培液+20%FBS的90 mm培样皿中, 于37℃, 50 mL/L CO2孵箱内培养3 d后, 即可自动分泌GM-CSF等细胞因子, 培养基过滤除菌, 将此分泌液分次加入BM-DC 的培养基中.

1.2 方法

Balb/c♀小鼠10只, 颈椎脱臼处死, 无菌取双侧股骨和胫骨, 用GKN 液冲洗出骨髓, 制成细胞悬液, 清洗后1: 10的体积比加入37℃预温的红细胞裂解液, 反复吹打混匀, 室温, 2-4 min, 加GKN10 mL终止反应, 离心洗涤后, 用RPMI 1 640 完全培液调整细胞浓度为 2×109/L, 接种于6孔培样板, 每孔2 mL, 加入细胞因子 mrGM-CSF, IL-4 各20 mg/L或腹膜培养液1 mL 隔天筛选换液. 分别在不同天数收取以上两种细胞, 制成细胞甩片或细胞涂片, -20℃保存备用, 并作部分 Gimesa 染色片. 取-20℃冷藏细胞甩片或细胞涂片, 复温后用冷丙酮固定10 min, 干燥后用0.01 mol/L PBS洗2次, 5 min/次, 按常规免疫组织化学染色方法依次用0.3 mL/L的H2O2, Avidin 液, Biotin 液、10 g/LBSA 封闭; 加一抗B7-2 和相应 Biotin化的二抗, 再加 ABC 复合物及 DAB 显色, 以上各步骤间均以PBS液洗3次, 最后脱水封片. 以相应的同型抗体染色作阴性对照. 取Balb/c ♀小鼠6只, 无菌开腹取脾细胞, 清洗破血去红细胞膜后, 制成 1 mL 细胞悬液, 尼龙毛柱分离 T细胞, 调整细胞浓度至2×109/L备用. 收集培养4, 7, 10 d的BM-DC, 丝裂霉素 C 处理后 (25 g/L, 37℃水浴 30 min), RPMI 1 640洗3次, 调整细胞浓度为2×108/L备用. 取DC和T细胞各0.1 mL, 加入96孔培养板作混合培养, 同时设单一T细胞孔和单一DC孔作对照, 培养72 h. 加入四甲基偶氮唑盐(MTT)10 mg, 37℃继续孵育4 h, 弃去孔内培养液, 每孔加入DMSO150 mL, 振荡10 min, 使结晶物充分溶解, 在酶免疫检测仪上测各孔A 490值, 计算刺激指数(stimulatory index), SI = 实验孔A值/对照孔A值.

2 结果
2.1 DC的光镜和扫描电镜观察

每只小鼠能分离出骨髓细胞约(3.5-4.0)×107个, 包括造血干细胞及内皮细胞、成纤维细胞等. 经24 h培养后, 在贴壁细胞表面有许多集落出现, 以粒细胞集落居多, 48 h后筛选吸弃悬浮的集落细胞, 剩小部分半贴壁半悬浮的DC集落存在, 到第4天时, 此类半贴壁集落数量剧增, 集落表面的细胞可见有长短不一的突起(图1, 2). 继续培养至6-8 d, 集落丰富, 并开始有大量细胞从集落中释放出来(图2), 释放的细胞突起较长. 细胞涂片 Gimesa 染色可见细胞核偏位, 突起较多. 每只小鼠在mGM-CSF和mIL-4培养7-8 d DC 的得率约为 6×106个. 每只小鼠腹膜培养24-48 h后, 有大量贴壁细胞贴壁生长, 少量DC前体细胞半贴壁状散在分布, 经筛选、扩增培养, 4 d时 DC 数量增多, 但只形成小集落(图3). 7-8 d, DC 数量较多, 并有部分细胞悬浮, 悬浮细胞有小的突起, 同时在此阶段细胞有一明显的增生高峰, 出现大量半贴壁半悬浮的集落, 集落表面的细胞有小的突起(图4, 图5). 10 d起, 集落依然大量存在, 并有部分细胞从集落上缓慢释放, 细胞涂片 Gimesa 染色见细胞核偏位, 胞质内有大量的囊泡结构. 每只小鼠在7-8 d DC 的得率约为 (2-3)×106个. 用扫描电镜检测细胞表面突起, 显示了DC的基本形态, 从细胞表面伸出许多的翼状突起, 突起表面几乎没有肌动蛋白, 表现为典型的树突状特征. 这一形态特征与DC的功能有密切关系, 这使其能有效地摄取抗原并选择性地作用于体内数量极少的抗原特异性淋巴细胞. 4 d免疫组织化学染色BM-DC仅MHC Ⅰ和B7-2呈弱阳性, 7 d BM-DC的 MHCⅠ, B7-2表达较高, 呈强阳性(图6).

图1
图1 GM-CSF+IL-4培养4 d BM-DC, 有细胞集落形成, ×100.
图2
图2 GM-CSF+IL-4培养7 d BM-DC, 细胞聚集, 大集落形成, ×200.
图3
图3 腹膜分泌液培养4 d BM-DC, 细胞增生, 开始形成小集落, ×200.
图4
图4 腹膜分泌液培养7 d BM-DC, 增生高峰期, 有大量集落生成, ×200.
图5
图5 培养7 d BM-DC, 细胞表面形成棘突样标志, ×400.
图6
图6 培养7 d BM-DC, B7-2免疫组织化学染色呈强阳性, ×400.
2.2 混合淋巴细胞增生反应(MLR)

培养4 d细胞因子组 Balb/c小鼠的 BM-DC 仅轻度促进 Balb/c小鼠T细胞的增生, 第7天 BM-DC刺激 T 细胞增生的能力增强, 刺激指数约为2-3倍; 培养7 d 腹膜组DC 无刺激 T 细胞增生的能力, 但培养第10天 DC 却表现出一定的刺激 T 细胞增生的能力(图7). 数据经 t检验(P<0.05)有统计学意义(表1).

表1 小鼠脾细胞对BM-DC 增生反应的刺激指数(n = 5).
分组4 d7 d10 d
1细胞因子组2.685a2.935ac2.234a
2腹膜刺激组2.138a1.803a2.457a
3T细胞对照1.2161.1781.018
图7
图7 不同培养时间的二组BM-DC刺激同种异体小鼠T细胞增生.
3 讨论

自1993年 Inaba et al用 GM-CSF 体外成功扩增 DC 以来, DC 的研究得到迅速发展. 骨髓中造血干细胞接种培养后, 在 GM-CSF、IL-4等 的作用下能向 DC 方向分化, 经历了一个由未成熟向成熟 DC 发育的过程. 早期未成熟 DC 的突起少, MHC 分子及共刺激分子 B7-1、B7-2的表达非常低, 无刺激 T 细胞增生的能力. 成熟后, 细胞突起增多, MHC 分子及共刺激分子的表达明显升高, 能强烈刺激 T 细胞的增生[29-32] . 这与我们观察到的实验结果完全符合, 即培养6-8 d 后 BM-DC 已基本成熟. 分离得到的 DC 前体细胞较少, DC 生长发育非常缓慢, 开始时仅少量的 DC 前体细胞在贴壁细胞的表面散在分布. 培养4 d, DC 前体细胞才开始出现小的集落. 至6-8 d, DC 前体细胞数量增多, 并出现一增生高峰, 有大量的半贴壁半悬浮集落生成; 少量悬浮细胞有小的突起. 此时DC 细胞表面分子 MHC class I, II和共刺激分子 B7-1, B7-2的表达都极低, 几乎没有刺激同种异体T细胞增生的能力. 这种 DC 的生物免疫特性与未成熟 DC 非常相似, 可能是诱导 T 细胞甚至凋亡的原因. 在培养中我们发现; 在7-8 d的增生高峰期, DC 有丰富的半贴壁集落生成; 并且从10 d起开始有部分细胞从集落中释放出来. 此时 DC 细胞表面分子表达有一定程度的升高, 以 MHC class II 和 B7-2为明显, 并且其刺激 T 细胞增生的能力也有增强.

目前尚无非常理想的能用于鉴定DC的特异性分子标志, 若要鉴定所得到的细胞是否为DC时, 往往是通过形态学、组合性细胞表面标志、混合淋巴细胞反应, (MLR)中刺激初始T细胞增生三个方面加以综合判断, 即具有典型树突状形态、膜表面高表达MHCII类分子、能移行至淋巴器官和刺激初始型T细胞增生活化, 并具有些相对特异性表面标志的一类细胞, 方能称之为DC. 当然, 也有数种DC相对特异性标志得到公认和应用, 例如33D1和NLDCl45是小鼠DC比较特异性的标志; OX62是大鼠DC比较特异性的标志, 而人DC的主要特征性标志为CDla和CD83.最近, 陆续一些新的DC特异性标志的报道, 如新西兰学者Hart所在的实验室制备一株鼠抗人DC的CMRF-44单抗, 他们利用此单抗动态地观察了从外周血单核细胞来源的人DC分化发育过程, 发现该单抗识别的是处于分化中期和成熟期的人DC. 可以预见, 若能寻找到更特异的DC标志、甚至不同状态或不同亚群DC的特异性标志, 将大大有利于DC工作的开展[33-36].

编辑: N/A

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