基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-02-15; 11(2): 204-208
在线出版日期: 2003-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i2.204
正常及实验性肝纤维化大鼠肝脏中的金属蛋白酶组织抑制因子-1
聂青和, 谢玉梅, 周永兴, 程勇前, 罗红, 罗新栋
聂青和, 谢玉梅, 周永兴, 程勇前, 罗红, 罗新栋, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
聂青和, 男, 1961-01-07生, 江西省进贤县人, 汉族. 医学博士, 博士后. 副教授、副主任医师. 从事传染病学临床与实验研究. 以第-作者发表论文100篇, 主编专著2部, 参加专著编写16部; 获军队科技进步二等奖1项, 军队科技进步三等奖2项; 获国家自然科学基金和中国博士后科学基金资助各1项.
基金项目: 中国博士后科学基金资助项目, 中博基[1999]10号.
通讯作者: 聂青和, 710038, 陕西省西安市, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心. nieqinghe@hotmail.com
电话: 029-3377742
收稿日期: 2002-10-25
修回日期: 2002-11-05
接受日期: 2002-11-20
在线出版日期: 2003-02-15

目的: 了解金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)在正常及实验性肝纤维化大鼠肝组织中的定位及表达状态.

方法: 用人血白蛋白免疫攻击的方法制备实验性免疫性肝纤维化大鼠模型, 以正常大鼠为对照. 采用免疫组化法及原位杂交技术分别检测肝脏中TIMP-1 mRNA和相关抗原表达, 同时用PCR技术检测肝脏中TIMP-1基因水平.

结果: 实验组肝脏中TIMP-1相关抗原表达在肌成纤维细胞、成纤维细胞, 以汇管区及纤维间隔中最明显, 阳性信号位于细胞胞质中, 未见细胞核表达. 原位杂交检测结果也展示了上述相同的分布和定位. 正常大鼠肝组织中可见TIMP-1基因表达, 但表达水平极低. 实验组肝组织中TIMP-1呈高水平表达.

结论: 在肝纤维化中, 成纤维细胞及肌成纤维细胞是TIMP表达的主要细胞. 随着病损肝脏中肝纤维化程度的加重, TIMP-1基因表达水平随之增高.

关键词: N/A

引文著录: 聂青和, 谢玉梅, 周永兴, 程勇前, 罗红, 罗新栋. 正常及实验性肝纤维化大鼠肝脏中的金属蛋白酶组织抑制因子-1. 世界华人消化杂志 2003; 11(2): 204-208
Expression of TIMP-1 in normal and fibrotic livers in rats
Qing-He Nie, Yu-Mei Xie, Yong-Xing Zhou, Yong-Qian Cheng, Hong Luo, Xin-Dong Luo
Qing-He Nie, Yu-Mei Xie, Yong-Xing Zhou, Yong-Qian Cheng, Hong Luo, Xin-Dong Luo, The Center of Diagnosis and Treatment for Infectious Diseases of PLA, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710038, Shaanxi Province, China
Correspondence to: Qing-He Nie, The Center of Diagnosis and Treatment for Infectious Diseases of PLA, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an, 710038, Shaanxi Province, China. nieqinghe@hotmail.com
Received: October 25, 2002
Revised: November 5, 2002
Accepted: November 20, 2002
Published online: February 15, 2003

AIM: To investigate the expression of TIMP-1 in normal and experimental fibrotic livers in rats.

METHODS: Hepatic fibrosis rat models were induced with human serum albumin, and normal rats were used as control. TIMP-1 mRNA and its related antigens in liver were examined with immunohistochemistry and in situ hybridization. Expression of TIMP-1 gene was detected with PCR.

RESULTS: The positive signal of TIMP-1 proteins was mainly located in cytoplasm rather than nucleus in hepatic myofibroblasts and fibroblasts, which dominated in portal areas and fibrous septums fibrotic rats. Such distribution of expression of TIMP-1 detected with immunohistochemistry was consistent with that in situ hybridization. The level of TIMP-1 expression in fibrotic rats was obviously higher than that in normal ones.

CONCLUSION: TIMP-1 was expressed dominantly in fibroblast and myofibroblast in fibrotic liver, the expression level increased with progression of liver injury and severity of hepatic fibrosis.

Key Words: N/A


0 引言

肝硬化是严重危害人类健康的常见病之一, 其病理学基础是肝纤维化, 后者是各种损肝因素(如病毒性肝炎等)所致慢性肝病发展为肝硬化的必经病理过程[1-5]. 肝纤维化的主要病理变化就是肝细胞外基质(ECM)在肝脏中过多沉积[6-10]. 目前研究表明, 肝脏ECM的代谢主要由基质金属蛋白酶(MMPs)所调节, MMPs促进ECM的降解, 而TIMPs通过抑制MMPs阻止ECM的降解, 从而形成和促进肝纤维化[11-13]. 但在正常和纤维化肝脏中由哪些细胞表达和合成TIMP-1目前的认识还不尽-致. 为此, 我们应用TIMP-1单克隆抗体(McAb)为试剂, 采用免疫组织化学法, 同时应用TIMP-1 cDNA探针为试剂采用检测正常及实验性肝纤维化大鼠肝脏中TIMPs相关抗原和mRNA的定位及表达状态. 鉴于TIMP-1在肝纤维化形成机制中的重要地位我们还应用PCR技术对其肝脏中TIMP-1基因表达水平进行研究, 现报告如下.

1 材料和方法
1.1 动物模型制备

Wistar大鼠♀, 体重120-150 g, 40只(购自本校动物中心). 参照王宝恩et al人应用的人血白蛋白免疫攻击的方法制备大鼠实验性免疫性肝纤维化模型[14], 抗大鼠IgG单克隆抗体购自法国Coulter公司. 同等条件下饲养正常Wistar大鼠20只做正常对照组. 具体选模过程如下: 将人血白蛋白(购自卫生部兰州生物制品研究所)用无菌生理盐水稀释, 与等量的不完全福氏佐剂(Sigma产品)乳化, 每只大鼠皮下多点注射, 每次注射0.5 mL(内含人血白蛋白4 mg), 共4次, 前2次间隔14 d, 第3、4次间隔10 d. 末次免疫后10 d取血测抗体, 取抗体阳性大鼠作实验. 尾静脉攻击注射人血白蛋白, 2次/wk. 第1周 2.5 mg/只, 以后再次攻击增加0.5 mg, 直至4.5 mg. 维持此量2 mo. 所有动物麻醉后处死取肝脏标本, -部分置于液氮中, -部分置于10%甲醛中固定统-备检, -部分置于戊二醛中固定电镜观察之用.

1.2 免疫组织化学染色

1.2.1 免疫组化染色: 具体实验操作参照我们既往开展的SP法免疫组化染色法[15-17]. 鼠抗TIMP-1 McAb购自美国Maxim生物技术公司, 产品编号为MAB-0282.主要步骤: (1)石蜡包埋4 mm连续切片, 脱蜡至水后; (2)抗原修复; (3)加10%正常血清封闭20 min; (4)加TIMP-1或TIMP-2 McAb(-抗) 4℃过夜; (5)加生物素二抗37℃, 恒温30-40 min; (6)加亲和素-过氧化酶溶液37℃, 20 min; (7)加DAB显色10 min; (8)苏木素复染, 酒精脱水, 二甲苯透明, 树胶封片, 镜检并照像记录.

1.2.2 免疫组化对照实验: 为保证实验结果的可靠性, 特别是免疫组织化学的特异性, 本实验采用省略-抗和二抗, 分别用兔血清和磷酸盐缓冲液代替-抗. 另设10例正常肝组织做对照.

1.2.3 图像分析: 每-玻片任选5个视野, 自动检测阳性细胞面密度, 取其平均值, 进行统计分析. 利用本校统计学教研室的统计程序包进行方差分析.

1.3 肝组织原位杂交

1.3.1 肝组织原位杂交: 具体实验操作参照我们既往开展的地高辛素标记探针原位杂交法[18-20]. TIMP-1原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司, 试剂号MK1 549.基本步骤为石蜡包埋4 um连续切片, 80℃烤片后, 二甲苯脱蜡, 酒精逐级水化, 盐酸酸化30 min, 30%过氧化氢3 mL封闭10 min, 加蛋白酶K消化30 min, 酒精逐级脱水固定, 37℃-40℃水浴箱内预杂交2 h; 将TIMP-1或TIMP-2 cDNA探针95℃ 10 min变性后迅速放入-20℃的冰箱内10 min, 滴加在经过预杂交处理的肝组织切片上, 置37℃水浴箱内过夜, 依次用2×SSC、1×SSC、0.2×SSC等洗片, 滴加BuffⅠ缓冲液, 滴加封闭液, 室温20 min, 滴加兔抗地高辛, 37℃、60 min, 滴加生物素化羊抗兔, 37℃、30 min, 滴加SABC, 37℃、30 min, DAB显色, 苏木素复染, 酒精脱水, 二甲苯透明, 封片, 镜检并照相记录.

1.3.2 图像结果判定: 原位杂交法半定量判断指标: 未见阳性细胞(-); 阳性细胞占肝小叶部分肝细胞的1/3以下(+); 1/3-2/3为(++); 2/3以上为(+++).

1.3.3 原位杂交特异性确证实验: (1)空白对照: 以预杂交液替代TIMP-1和TIMP-2 cDNA探针对阳性肝组织切片进行杂交. (2)阴性对照: 用TIMP-1和TIMP-2 cDNA探针对10例正常肝组织进行原位杂交试验.

1.4 TIMP-1 PCR检测

1.4.1 TIMP-1 PCR引物序列: 见表1.

表1 TIMP-1、β-actin引物序列.
引物核苷酸序列产物位置(bp)
TIMP-1 正义链5'-TTCGTGGGGACACCAGAAGTC-3'482
反义链5'-TATCTGGGACCGCAGGGACTG-3'
b-actin 正义链5'-GGAGAAGATGACCCAGATCA-3'234
反义链5'-GATCTTCATGAGGTAGTCAG-3'

1.4.2 PCR反应: 用Promega公司生产的Total RNA Isolation System提取肝组织总RNA. PCR反应体系为20 μl, 内含cDNA 2 μL, 10×buffer 2 μL, 4×dNTP(2 mM) 2 μL, TIMP-1、β-actin引物(10mM)各2 μL, Taq酶1 U超重水补至20 μl. 反应参数为: 97℃预变性2 min; 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸50 s, 30个循环; 最后72℃延伸7 min.

1.4.3 扩增产物定量分析: 取PCR扩增产物10 mL加入2%的琼脂糖凝胶孔中在TAE缓冲液50V, 电压电泳1 h, 溴化乙锭显色后成像定量分析, 用TIMP-1/β-actin比值表示TIMP-1表达水平.

1.5 病理形态学观察

常规HE染色观察肝组织学改变, Von Gieson、Masson胶原纤维特殊染色观察胶原增生情况等.

1.6 电镜观察

取正常及实验性肝纤维化大鼠新鲜肝脏, 戊二醛固定电镜检查.

统计学处理 数据用mean±SD表示. 利用本校统计学教研室的统计程序包行方差分析.

2 结果
2.1 病理学结果

光镜下可见实验性肝纤维化大鼠肝组织中网状纤维及胶原纤维于汇管区增生, 且向外延伸. 同时, 于中央静脉周围增生并沿肝窦散在分布, 互相连结, 纤维结缔组织围绕肝小叶, 可见假小叶形成(图1). 并可在汇管区及中央静脉周围有炎性细胞浸润. 对照组肝脏呈正常结构.

图1
图1 大鼠肝组织VG染色(假小叶形成)(×100).
2.2 电镜观察

早期可见肝星状细胞(HSC)增生活跃, 内有丰富的粗面内质网和脂质, HSC周围可见较明显的胶原纤维(图2). 以后可见肌成纤维细胞形成, 分布于汇管区, 其周围有大量胶原沉积, 沉积的胶原形成较宽的分隔(图3). Disse间隙内大量胶原纤维沉积. 变性的肝细胞中可见大量肿胀的线粒体和少量脂滴.

图2
图2 大鼠模型肝脏中激活的肝星状细胞及周围大量胶原纤维(电镜10 K).
图3
图3 汇管区变大, 胶原纤维增生明显, 并可见大量成纤维细胞(电镜3 K).
2.3 TIMP-1的表达及定位

实验性肝纤维化大鼠肝脏中TIMP-1相关抗原表达在肌成纤维细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞中, 以汇管区及纤维间隔中最明显. 阳性信号呈棕黄色颗粒状, 分布于上述细胞质内, 未见细胞核着色(图4). 正常大鼠肝脏仅在血管内皮细胞中有弱阳性表达. 图像分析显示实验组显著高于正常组(P<0.001), 见表2.原位杂交检测结果也展示了上述相同的分布及定位(图5).

表2 大鼠肝脏中TIMP-1相关抗原表达.
组别nTIMP-1
实验组20482.50±65.00
正常组1059.80±20.31
图4
图4 大鼠肝组织中TIMP-1免疫组化(×400).
图5
图5 大鼠肝组织中TIMP-1原位杂交(×400).
2.4 对照实验

为保证免疫组化实验结果的可靠性, 本实验采用省略-抗和二抗, 分别用鼠血清和磷酸盐缓冲液代替. 检测结果均为阴性, 实验证实此免疫组化实验结果是特异的.

2.5 原位杂交特异性确证试验

用预杂交液代替TIMP-1 cDNA探针杂交后, 结果为阴性.

2.6 TIMP-1基因表达水平

正常大鼠肝组织中可见TIMP-1基因表达, 但表达水平极低. 实验性肝纤维化大鼠肝组织中TIMP-1基因表达水平明显高于正常组(P<0.001), 见表3.

表3 大鼠肝脏中TIMP-1基因表达.
组别nTIMP-1/β-actin
实验组201.86±0.47
正常组100.36±0.08
3 讨论

选择和建立理想的动物模型是肝纤维化研究的必要条件之一, 因为可对其相关病因, 重要发病机制, 诊断条件的摸索以及研究行之有效的治疗方法并筛选评价抗肝纤维化药物均具有重要意义. 理想的动物模型应当是: (1)与人类疾病特征相似; (2)病变有-定发展过程, 即明显分期; (3)形成率高, 死亡率低; (4)造模方法简便易行; (5)动物易获得, 经济实用.

早在1960年代Paronetto和Popper就证明了免疫反应能引起肝损伤[21]. 抗原可用猪、牛、马血清, 猪血白蛋白, 血清球蛋白等反复注射, 5 wk引起肝纤维化, 10 wk引起肝硬化, 但由于过敏反应动物死亡率较高. 我们在国内王宝恩et al[14]介绍的实验性免疫性肝纤维化模型的基础上, 参考多种肝纤维动物模型成功的经验, 加以改良, 即在造模型过程中第1、2次尾静脉攻击时给大鼠注射小剂量地塞米松, 使造模过程中动物死亡率明显下降, 成功率提高. 病理学诊断为肝纤维化, 而且肝纤维化持续时间长达363 d. 此模型形式机制为白蛋白免疫复合物所致的Ⅲ型变态反应. 电镜所见提示上述病理过程激发了静止的肝星状细胞(HSC)增生, 并向肌成纤维细胞转化, 进而分泌大量胶原.

MMPs活性组织抑制物TIMPs, 广泛存在于许多组织中. 目前发现有4种TIMP, 仅有TIMP-1、TIMP-2存在于肝组织中, 他与活性MMPs以1: 1浓度结合形成复合体, 从而抑制MMPs的活性, 这种结合是不可逆转的[22-26]. TIMPs对MMPs的抑制活性, 由于MMPs的种类不同, 其敏感性存在着差异, 如TIMP-1对MMP-1、前MMP-9; TIMP-2对MMP-2、MMP-9、前MMP-2均显示出较强的抑制活性. 目前发现在病损肝脏中TIMP-1明显增高, 出现的时间较早, 幅度较大, 因此有较多学者把他看作是肝纤维化发生过程中一个非常重要的促发因素, TIMP-1通过对MMP-1等金属蛋白酶活性的抑制促进ECM的沉积, 其中TIMP-1较TIMP-2升高明显. 故而TIMP-1的高表达严重抑制了MMP而反映了肝纤维化的严重程度. 我们进行免疫组化观察发现实验性免疫性肝纤维化大鼠肝脏中仅肌成纤维细胞、成纤维细胞有TIMP-1蛋白的高表达, 以汇管区及纤维间隔中最明显. 而正常大鼠肝仅在血管内皮细胞中有弱阳性表达. 原位杂交检测结果-致.

1997年Roeb et al[27]通过原位杂交显示在CC14和胆管结扎大鼠肝损伤模型中, 肝细胞和几乎所有间质细胞均有TIMP-1 mRNA的表达, 以炎症区域中的脂肪样细胞中表达最明显. 而我们观察仅有肌成纤维细胞, 成纤维细胞, 血管内皮细胞中有TIMP-1 mRNA的高表达, 以汇管区及纤维间隔中最为明显, 免疫组化也展示了相同的结果. 这种差异的原因是动物模型不同所致, 还是其他什么因素, 有待进一步研究证实.

TIMP-1基因表达结果分析, 随着肝纤维化程度的加重, 肝组织TIMP-1基因表达水平增强, 这是由于TIMP基因表达增强, 抑制了MMP-1对胶原纤维的降解, 使胶原纤维在肝脏中不断沉积, 导致肝纤维化. TIMP-1基因表达增加, 其表达产物也相应增高, 其血清TIMP-1水平也相应发生改变. 1996年Iredale et al[28]从实验性肝纤维化肝脏中分离出肝细胞、肝星状细胞(HSC)、Kupffer细胞, 并行细胞总RNA的Northern杂交发现肝细胞并不表达TIMP-1 mRNA. 我们应用PCR技术检测大鼠肝脏中TIMP-1基因表达, 因取材为肝脏, 包含了肝细胞、HSC、Kupffer细胞等肝脏中存在的细胞群. 正常大鼠肝脏中TIMP-1基因水平表达水平较低, 而肝纤维化大鼠肝脏中TIMP-1基因呈高水平表达. 是否肝细胞不表达TIMP-1有待实验的进一步研究确证. 肝纤维化过程中TIMP-1表达明显增加, 且主要为成纤维细胞, 肌成纤维细胞产生, 这可能是激活HSC的结果, 肝纤维化实质上是慢性肝损伤的修复反应, 主要是由于细胞因子介导的细胞-细胞相互作用, 以及基质细胞相互作用引起的HSC激活, 反复的肝损伤引起HSC活化的持续. 因此, HSC的激活是肝纤维化过程中的主要病理过程. 有趣的是, 急性肝损伤并不引起肝纤维化. 体外实验也证实, 静止的HSC未见凋亡现象存在[29]. 这说明肝纤维化的发生机制较为复杂[30-38], 仍有不少问题有待进一步研究和阐明.

虽然MMPs、TIMPs与肝纤维化的发病机制密切相关, 但对TIMPs的研究只是刚刚开始, 肝纤维化时TIMP-1表达增强的机制尚不十分清楚, 仍有许多问题尚在探索之中[38-43]. 加强TIMPs的研究对肝纤维化的诊治及其发病机制的研究具有重要意义.

编辑: N/A

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