吲哚美辛对野生型p53转染的结肠癌细胞株SW480的影响

摘要

目的

探讨吲哚美辛抗结肠癌作用是否呈p53依赖性及其部分分子机制.

方法

采用含突变型p53的SW480细胞株为研究对象, 利用基因转染技术, 将野生型p53转染SW480细胞. 不同浓度的吲哚美辛进行干预, 采用吖啶橙、溴化乙锭荧光染色, 荧光显微镜及透射电镜下观察wtp53/SW480细胞凋亡; Western 斑点免疫印迹检测wtp53/SW480细胞中Bcl-2、 Bax及p21^WAF1/CIPI蛋白表达.

结果

吲哚美辛诱导野生型p53转染的wtp53 /SW480细胞凋亡, 出现形态学改变: 即细胞核固缩、裂解, 核碎片及凋亡小体形成. 凋亡细胞计数显示该作用呈浓度－时间依赖性, 其中600 μmol/LIN作用于wtp53/SW480细胞72 h, 其凋亡细胞百分率为60.1±2.5%; 而对照组其凋亡细胞百分率为5.0±2.0%, P<0.01, 二者比较有显著性差异. 吲哚美辛作用于wtp53/SW480细胞24 h, 其Bcl-2蛋白表达水平下调, 呈浓度依赖性, 而Bax蛋白表达无改变; 未转染的SW480细胞中Bcl-2, Bax蛋白均无影响. 吲哚美辛作用于wtp53/SW480细胞24 h, 其p21^WAF1/CIPI蛋白表达水平随着一定范围内吲哚美辛浓度的增加而逐渐上调, 以400 μmol/L吲哚美辛作用最强, 600 μmol/L吲哚美辛作用后回到基础水平. 而在未转的SW480细胞中p21^WAF1/CIPI蛋白的表达无明显改变.

结论

IN通过下调Bcl-2蛋白, 上调p21^WAF1/CIPI蛋白的表达来诱导wtp53/SW480细胞凋亡.

关键词: N/A

Effect of indomethacin on induction of apoptosis in colonic cancer cell line SW480 transferred by wild-type p53 gene

Gui-Ying Zhang, Mei-Hua Xu, Zhao-Xia Xie, Chun-Mei He

Gui-Ying Zhang, Mei-Hua Xu, Zhao-Xia Xie, Department of Gastroenterology, Xiangya Hospital, Zhongnan University, Changsha 410008, Hunan Province, China

Chun-Mei He, Cancer Research Institute, Xiangya Medical College, Zhongnan University, Changsha 410078, Hunan Province, China

Supported by: the Natural Science Foundation of the Ministry of Health of China, No. 98-2-088.

Corresponding author: Gui-Ying Zhang, Department of Gastroenterology, Xiangya Hospital, Zhongnan University , 141 Xiangya Road, Changsha 410008, Hunan Province, China. meihuaxu2001@yahoo.com.cn

Received: October 18, 2002
Revised: March 20, 2003
Accepted: May 21, 2003
Published online: November 15, 2003

Abstract

AIM

To investigate the anti-tumor effect of indomethacin on colon cancer.

METHODS

SW480 cells were transferred by wtp53 gene, treated with different concentrations of indomethacin. Apoptosis was analyzed by acridine orange and ethidium bromide staining, and electron microscopy. Expressions of Bcl-2, Bax and p21WAF1/CIPI protein were detected by Western blotting.

RESULTS

Indomethacin induced apoptosis in wtp53/SW480 cells. Typical cell morphological changes included cytoplasm and nuclear shrinkage, nuclear fragmentation and formation of apoptotic bodies. The count of apoptotic cells was dose and time-dependent, and the apoptotic cells accounted for 5.0±2.0% in SW480 cells, 60.1±2.0% in wtp53/SW480 cells treated with 600 μmol/L indomethacin for 72 h (P<0.01), with a significant difference between the two groups. The expression of Bcl-2 protein of wtp53/SW480 cells was down-regulated by indomethacin in a dose dependent manner. The expression of Bax protein did not change, and the expressions of Bcl-2 and Bax protein of SW480 cells did not change either. The expression of p21^WAF1/CIPI protein of wtp53/SW480 cells was up-regulated, reaching the maximal level at the concentration of 400 μmol/L indomethacin and returning to control level at the concentration of 600 μmol/L indomethacin

CONCLUSION

Indomethacin could induce apoptosis in wtp53/SW480 cells by down-regulating the expression of Bcl-2 protein and up-regulating the expression of p21^WAF1/CIPI protein, but no change in Bax protein.

Key Words: N/A

0 引言

转染野生型p53 (wild-type p53, wtp53)表达质粒, 可引起p53缺失或突变的肿瘤细胞凋亡和/或抑制肿瘤细胞生长, 予烷化剂作用后p21^WAF1/CIP1 蛋白表达明显增加[1]. 然而, 有研究者将wtp53转染至SW480细胞中, 结果显示p53表达的修复不足以引起转染的结肠癌细胞的凋亡[2]. 研究证实, 非甾体类药物(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAID)可通过非选择性抑制环氧化酶(cyclo-oxygenase, COX), 而抑制对肿瘤生长和转移有明显促进作用的PGE2的产生[3,4]; 诱导凋亡是NSAID抗肿瘤作用的机制之一[5-12]. 为探讨非甾体类药物吲哚美辛(indomethacin, IN )诱导肿瘤细胞凋亡时凋亡相关蛋白Bcl-2, Bax蛋白的表达是否下调或上调, p21^WAF1/CIPI蛋白表达上调是否存在依赖性p53-p21^WAF1/CIPI途径, 我们将wtp53 基因转染至SW480细胞后给予一定浓度的吲哚美辛干预, 吖啶橙和溴化乙锭染色后, 荧光显微镜及透射电镜下观察凋亡细胞形态学改变; Western印迹检测IN 诱导wtp53/SW480细胞凋亡时p21^WAF1/CIPI , Bcl-2及Bax蛋白的表达.

1 材料和方法

1.1 材料

含mtp53的 SW480人结肠癌细胞株, 购自ATCC. wtp53/PLXSN重组体质粒为湘雅医院周晓娟老师惠赠; DMEM培基, FuGENE^TM6 transfection reagent, G418为湘雅医学院细胞生物室关勇军老师惠赠; Qiagen质粒抽提纯化试剂盒、吖啶橙(AO)、溴化乙啶(EB)为Sigma公司产品; 兔源性多克隆抗体Bcl-2、Bax、p21^WAF1/CIPI为Santa Cruz产品; β-action抗体为湘雅医学院贺智敏老师惠赠; BCA浓度测定试剂盒为Pierce Chemical Co产品; ECL发光试剂盒为NENTM Life Science Product; Trizol试剂为Gibco公司产品; 逆转录试剂盒、辣根过氧化物酶标记羊抗兔、羊抗鼠二抗, NC膜、Taq DNA 聚合物酶、dNTPs、PCR Marker为华美生物工程公司或Promega 公司产品.

1.2 方法

wtp53/PLXSN质粒转染SW480细胞按(Clin Cancer Res 1996; 2: 1639)略加改进. 用脂质体将wtp53/PLXSN质粒转染至SW480细胞, 转染48 h后加G418 800 mg/L, 以后保持200 mg/L G418筛选. 细胞克隆化, 随意挑选G418抗性克隆wtp53/SW480细胞, 200 mg/L G418浓度维持扩大培养. 空白载体PLXSN 转染SW480细胞作为对照. RT-PCR检测wtp53/SW480细胞外源性wtp53基因的表达 按Trizol试剂盒操作说明抽取两组 wtp53/SW480细胞、SW480细胞、空白载体转染的SW480的总RNA. cDNA合成: 于0.5 mL Eppendorf 内依次加入25 mmol/L MgCl₂ 4 μL, 10×RT buffer 2 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, Rnasin 40 U, AMV 200 U, Oligo(dT)15 1 μL, 反应终体积为20 μL, 离心后于42 °C反应60 min, 95 °C 5 min. PCR反应: 50 μL反应体系中含cDNA模板5 μL, 10×PCR buffer 5 μL, 正向引物和反向引物各50 pmol, 10 mmoldNTP 2 μL, Taq 酶2U. 循环条件为: 94 °C预变性3 min, 然后94 °C 50 s, 53 °C30 s, 72 °C 40 s, 共30个循环, 最后72 °C延伸7 min.

1.3 实验干预

取指数生长期wtp53/SW480细胞, 调整细胞浓度为1×10⁸/L, 接种于含150 mL/L FCS的DMEM培养液的6孔培养板中, 设置空白对照组、实验对照组(DMSO)、实验组: 分别加入IN使其终浓度为100, 200, 400, 600 μmol/L, 培养24 h, 48 h, 72 h后, 进行相关检测.

1.3.1 wtp53/SW480细胞荧光染色 各孔细胞用胰蛋白酶消化, 取细胞悬液5 μL(含细胞数1×10⁸/L)于载玻片上, 加荧光染色液(含200 mg/L AO+EB) 5 μL染色1 min, 荧光显微镜下观察并摄影. 计算200个细胞及凋亡细胞百分率, 每次实验重复3次.

1.3.2 透射电镜检测 将细胞轻轻刮下来, 离心(500 r/min 5 min), 戊二醛固定2 h以上; 0.1 mol/L PBS清洗细胞团后, 用20 g/L锇酸固定1 h; 0.1 mol/L PBS清洗细胞团, 然后丙酮梯队脱水; 环氧树脂和丙酮1: 1, 37 °C下浸泡24 h; 纯环氧树脂包埋, 60 °C烤箱, 24 h; LKB-III型超薄切片机切片, 厚度500-600 nm; 铅铀双重染色后H -600透射电镜下观察.

1.3.3 Western 斑点印迹法 PBS漂洗提取上述各组细胞, 调整细胞数为1×10⁶, 5 000 r/min 4 °C离心10 min 收集细胞, 加入裂解液抽提蛋白, BCA方法测定蛋白质浓度. 每样品取80 μg总蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离2-3 h后, 100V电转移至NC膜, PBS-T溶解的50 g/L脱脂牛奶中封闭4-6 h , 分别将兔源性多克隆抗体Bcl-2 (1: 500), Bax (1: 500), P21WAF1/CIPI(1: 500)一抗稀释于50 g/L脱脂牛奶中, 与膜温育1 h, PBS-T洗膜4×15 min , 辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(1: 50)与膜温育1 h, PBS-T洗膜4×15 min; ECL检测试剂与膜作用3 min后暗室中曝光, X线片显影、定影.

取出以上滤膜, 放入PBS-T中漂洗30 min. 鼠抗人单克隆抗体β-action 1:10000稀释于50 g/L脱脂牛奶中, 与NC膜温育1 h, 辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体(1: 50)与膜温育1 h, ECL检测试剂与膜作用3 min后暗室中曝光, X线片显影、定影.

统计学处理 凋亡细胞百分率均数以mean±SD表示, 组间差异用t检验, 采用SPSS 10.0处理.

2 结果

wtp53/PLXSN质粒转染SW480细胞系, 转染48 h后800 mg/L G418筛选. 经筛选8-10 d后可见抗G418克隆出现, 随机挑选G418抗性克隆wtp53/SW480扩大培养后作进一步鉴定. Trizol一步法提取wtp53/SW480细胞的总RNA, 逆转录合成cDNA, 并作模板进行PCR扩增, PCR引物为: p53基因的正向引物Pf: AGA, ATG, CCA, GAG, GCT, GCT, C, 反向引物Pr: CTC, GGA, TAA, GAT, GCT, GAG, GA, 扩增片段大小为397 bp; GAPDH上游引物Pf: CCT, CAG, TTG, CCT, AAA, CCA, GCA, 下游引物Pr: CCA, CTA, AAA, CCT, CCC, TAG, AGC, 扩增片段大小为240 bp. PCR产物用10 g/L凝胶电泳(含0.5 mg/L EB)检测, 并选用GAPDH作为内对照.

2.1 细胞凋亡形态学

荧光显微镜及透射电镜下观察, 未经IN处理的wtp53/SW480细胞, 染色后细胞形态显示肿瘤细胞核大, 染色质疏松细致, 外形较规则, 呈圆形或椭圆形.大于或等200 μmol/L IN作用于wtp53/SW480细胞72 h后引起凋亡典型的形态学改变, 主要包括细胞体积缩小, 细胞核固缩、偏向一边、裂解、核碎裂、呈桔红色等, 细胞器及细胞膜完整, 密度增高. 染色质浓集成块、靠边, 凋亡小体形成. 凋亡细胞计数结果显示未经IN作用的wtp53/SW480细胞凋亡不明显; 随着一定范围内IN浓度的增加及作用时间的延长, wtp53/SW480细胞凋亡百分率而逐渐增加(表1).

表1 IN促wtp53/SW480细胞凋亡 (%, mean±SD, n = 3).

IN (μmol/L)	24 h	48 h	72 h
对照组	1.3 ±0.6	1.7±0.6	5.0±2.0
DMSO组	1.0±0.0b	2.3±0.6b	5.5±1.0b
100	6.0±2.0	10.2±0.6	24.5±1.7
200	7.8±0.6	13.7±2.5	39.3±2.5
400	10.3±0.6	20.8±1.0	46.0±2.0b
600	14.2±1.2	28.0±2.0	60.1±2.5b

^bP<0.01, vs对照组比较.

2.2 p21^WAF1/CIPI蛋白表达

不同浓度的IN作用于wtp53/SW480细胞24 h后, Western印迹检测发现wtp53/SW480细胞中p21^WAF1/CIPI蛋白表达水平在一定范围内随着IN作用浓度的增加而逐渐上调, 且于400 μmol/L IN达到最高表达水平, 600 μmol /L I作用后则下降至基础水平. 而在未转染的SW480细胞中p21 ^WAF1/CIPI蛋白表达水平无变化(图1).

图1 IN影响SW480细胞转染前后p21WAF1/CIPI蛋白表达. 1: control; 2: DMSO; 3: 100 μmol/L IN; 4: 200 μmol/L IN; 5: 400 μmol/L IN; 6: 600 μmol/L IN.

2.3 Bcl-2、Bax蛋白表达

wtp53/SW480细胞中Bcl-2蛋白表达随着一定范围内IN的浓度增加而逐渐减弱, Bax 蛋白的表达无明显改变. SW480细胞中Bcl-2蛋白、Bax 蛋白均无变化( 图2、图3). 为确定Bcl-2, Bax蛋白表达在细胞中的相对含量, 我们测定了Bcl-2, Bax蛋白的光密度值, 结果发现随着一定范围内IN浓度增加, Bcl-2/Bax比率呈逐渐下降趋势(图4).

图2 IN影响SW480细胞转染前后Bcl-2蛋白表达. 1: control; 2: DMSO; 3: 100 μmol/L IN; 4: 200 μmol/L IN; 5: 400 μmol/L IN; 6: 600 μmol/L IN.

图3 IN影响SW480细胞转染前后Bax蛋白表达. 1: control; 2: DMSO; 3: 100 μmol/L IN; 4: 200 μmol/L IN; 5: 400 μmol/L IN; 6: 600 μmol/L IN.

图4 IN影响wtp53/SW480细胞中Bcl-2/Bax比率. 1: control; 2: DMSO; 3: 100 μmol/L IN; 4: 200 μmol/L IN; 5: 400 μmol/L IN; 6: 600 μmol/L IN.

3 讨论

结肠癌中存在高频率的p53突变表达, 突变型p53既不使细胞生长停滞, 亦不能诱导细胞凋亡, 故结肠肿瘤对常规化疗药物呈现抵抗, 对DNA损伤剂的辅助治疗也不很敏感. p53基因是基因研究中最为广泛深入的肿瘤基因之一, 野生型p53基因转染结合放射、化疗治疗可明显诱导凋亡, 并减少化疗或放疗的剂量, 减少副作用 [13,14]. 有作者认为对于存在p53突变或缺失的肿瘤, 放、化疗敏感性降低, 甚至不敏感, 可通过基因转染增强其对放、化疗的敏感性[15-20].

SW480细胞无自发性凋亡发生, 对非甾体类药物苏林达二硫化物反应呈现一定的凋亡抵抗[2]. 我们将wtp53基因转染至SW480细胞, 通过RT-PCR证实转染成功后, 不同浓度的IN作用于wtp53/SW480细胞, 出现细胞体积缩小, 细胞核体积缩小、固缩, 染色质浓集成块, 靠边, 凋亡小体形成, 从形态学上证实细胞发生了凋亡, 细胞形态及研究结果与Dai et al [21]的报道相一致. 未经IN处理的wtp53/SW480细胞, 72 h后凋亡细胞的百分率仅为5.0±2.0%; 经IN处理的wtp53/SW480细胞, 随IN在一定范围内剂量的增加其凋亡细胞百分率明显增加, 600 μmol/L IN作用于wtp53/SW480细胞 72 h, 其凋亡细胞的百分率为60.1±2.5%. 荧光染色及电镜超微结构的变化从形态学上证实IN诱导wtp53/SW480细胞凋亡. 我们的实验表明IN诱导SW480细胞凋亡存在p53依赖且呈剂量依赖.

肿瘤生长由细胞增生、生长停滞及细胞凋亡来调节, 随着人们对细胞凋亡的研究深入, 在细胞凋亡调控机制方面, Bcl-2基因家族是迄今研究最为深入广泛的凋亡调控基因之一. 实验证明, Bcl-2家族的凋亡调控效应并不要求新的蛋白翻译, 他的作用主要位于蛋白水平. 其家族中包括阻碍细胞死亡和促细胞死亡两组成员, 一般位于细胞质和细胞膜, 许多BCL-2相关蛋白包含一个C-末端[22]. Bcl-2蛋白表达产物定位于线粒体膜、核膜和内质网[23-25], 其主要生理功能是阻抑凋亡; Bax蛋白为一胞质内蛋白, 与Bcl-2蛋白有高度同源性, 为Bcl-2 抗凋亡效应的拮抗剂. 大多数Bcl-2家族蛋白既能自身形成同二聚体, 也能和家族中其他蛋白形成异二聚体[26-28]. Bax和Bcl-2蛋白形成异二聚体抑制细胞凋亡, 和Bax形成同二聚体有促凋亡作用, 但有研究表明Bcl-2/Bax比例可能是决定细胞对凋亡刺激信号的敏感性的重要因素之一, Bcl-2/Bax比例比Bcl-2/单独作用更为重要[29,30]. 我们知道在大多数结直肠肿瘤中Bcl-2高表达, Bcl-2蛋白在p53阳性肿瘤的表达明显高于p53阴性肿瘤. Bcl-2蛋白在抑制p53介导的细胞死亡过程中起作用, 抑制Bcl-2有助于抗肿瘤治疗, 在Bcl-2基因的5'端非编码区存在一个p53负反应元件, 他与p53蛋白结合形成一个杂合性启动子, 使p53转录抑制作用得以发挥, 下调Bcl-2蛋白表达, 呈典型的p53依赖途径. Bax基因启动子亦存在p53结合的序列, Bax的表达受p53基因的上调, 表明Bax基因亦可能是p53诱导凋亡途径中的一个下游分子, 提示p53直接作用于Bax基因促进其转录, 研究表明有p53介导的凋亡50%需要Bax基因的参与[31]. 因此, 许多研究表明肿瘤细胞的生长停滞和凋亡调控中p53、p21^WAF1/CIPI、Bcl-2和Bax起重要作用[14].

为了进一步研究非甾体类消炎药IN抑制肿瘤细胞增生和诱导凋亡的作用机制, 本研究采用 Western blotting 方法检测了wtp53转染SW480细胞前后p21^WAF1/CIPI、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平. 结果显示, IN作用于wtp53/SW480细胞, 其Bcl-2蛋白的表达随一定范围内IN浓度的增加而逐渐减弱, Bax蛋白表达水平无变化, 而在SW480细胞中其Bcl-2蛋白及Bax蛋白水平均无影响, 提示IN诱导结肠癌细胞凋亡的过程中依赖p53的存在. 测定Bcl-2, Bax蛋白的光密度值, 结果发现随着一定范围内IN浓度增加, Bcl-2/Bax比率呈逐渐下降趋势, 结果表明Bcl-2/Bax比率下降可能是IN 诱导wtp53/SW480细胞凋亡的机制之一. 本研究同时发现: IN作用于wtp53/SW480细胞, p21^WAF1/CIPI蛋白表达明显增强, 且随IN在一定范围内的浓度增加而逐渐递增, 而在SW480细胞中p21^WAF1/CIPI蛋白表达水平无变化, p53转染SW480细胞导致p21^WAF1/CIPI表达水平增高, 二者相互作用, 提示IN诱导wtp53/SW480细胞凋亡过程可能存在着p53介导p21^WAF1/CIPI途径. p21^WAF1/CIPI蛋白是细胞周期素依赖激酶抑制剂(cycle-dependent kinase inhibitor, CDI)的主要家族成员之一, 具有与p53结合的特异核苷酸序列, 其表达由抑瘤基因p53调节[32-34]. 后者为基因转录调节剂, 能促使p21^WAF1/CIPI活化[35,36]. p21^WAF1/CIPI表达水平的增高可降低细胞周期素依赖激酶(cycle-dependent kinases, CDKs)活性, 导致细胞周期停滞在G1期, 最终导致细胞凋亡. 本结果提示: IN通过下调Bcl-2蛋白表达, 上调p21^WAF1/CIPI蛋白的表达来诱导wtp53/SW480细胞凋亡, 存在p53-p21^WAF1/CIPI依赖途径.

备注

$[Footnotes]

参考文献

1.	Shao J, Fujiwara T, Kadowaki Y, Fukazawa T, Waku T, Itoshima T, Yamatsuji T, Nishizaki M, Roth JA, Tanaka N. Overexpression of the wild-type p53 gene inhibits NF-kappaB activity and synergizes with aspirin to induce apoptosis in human colon cancer cells. Oncogene. 2000;19:726-736.  [PubMed]  [DOI]

2.	Richter M, Weiss M, Weinberger I, Furstenberger G, Marian B. Growth inhibition and induction of apoptosis in colorectal tumor cells by cyclooxygenase inhibitors. Carcinogenesis. 2001;22:17-25.  [PubMed]  [DOI]

3.	Eli Y, Przedecki F, Levin G, Kariv N, Raz A. Comparative effects of indomethacin on cell proliferation and cell cycle progression in tumor cells grown in vitro and in vivo. Biochem Pharmacol. 2001;61:565-571.  [PubMed]  [DOI]

4.	Ricchi P, Zarrilli R, Di Palma A, Acquaviva AM. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs in colorectal cancer: from prevention to therapy. Br J Cancer. 2003;88:803-807.  [PubMed]  [DOI]

5.	Lonnroth C, Andersson M, Lundholm K. Indomethacin and telomerase activity in tumor growth retardation. Int J Oncol. 2001;18:929-937.  [PubMed]  [DOI]

6.	Thurnher D, Bakroeva M, Formanek M, Knerer B, Kornfehl J. Non-steroidal anti-inflammatory drugs inhibit telomerase activity in head and neck squamous carcinoma cell lines. Head Neck. 2001;23:1049-1055.  [PubMed]  [DOI]

7.	Ogino M, Hisatomi H, Murata M. Indomethacin suppresses the growth of colon 26, Meth-A and FM3A tumors in mice by reducing the prostaglandin E2 content and telomerase activity in tumor tissues. Jpn J Cancer Res. 1999;90:758-764.  [PubMed]  [DOI]

8.	Chan TA. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, apoptosis, and colon-cancer chemoprevention. Lancet Oncol. 2002;3:166-174.  [PubMed]  [DOI]

9.	Kim TI, Jin SH, Kim WH, Kang EH, Choi KY, Kim HJ, Shin SK, Kang JK. Prolonged activation of mitogen-activated protein kinases during NSAID-induced apoptosis in HT-29 colon cancer cells. Int J Colorectal Dis. 2001;16:167-173.  [PubMed]  [DOI]

10.	Oliver L, Cordel S, Barbieux I, LeCabellec MT, Meflah K, Gregoire M, Vallette FM. Resistance to apoptosis is increased during metastatic dissemination of colon cancer. Clin Exp Metastasis. 2002;19:175-180.  [PubMed]  [DOI]

11.	Kralj M, Kapitanovic S, Kovacevic D, Lukac J, Spaventi S, Pavelic K. Effect of the nonsteroidal anti-inflammatory drug indomethacin on proliferation and apoptosis of colon carcinoma cells. J Cancer Res Clin Oncol. 2001;127:173-179.  [PubMed]  [DOI]

12.	Loftin CD, Trivedi DB, Langenbach R. Cyclooxygenase-1-selective inhibition prolongs gestation in mice without adverse effects on the ductus arteriosus. J Clin Invest. 2002;110:549-557.  [PubMed]  [DOI]

13.

Sasaki Y, Morimoto I, Ishida S, Yamashita T, Imai K. Adenovirus-mediated transfer of the p53 family genes, p73 and p51/p63 induces cell cycle arrest and apoptosis in colorectal cancer cell lines: potential application to gene therapy of colorectal cancer. Gene Ther. 2001;8:1401-1408.  [PubMed]  [DOI]

14.	Bukholm IK, Nesland JM. Protein expression of p53, p21 (WAF1/CIP1), Bcl-2, Bax, cyclin D1 and pRb in human colon carcinomas. Virchows Arch. 2000;436:224-228.  [PubMed]  [DOI]

15.

Sasaki Y, Morimoto I, Ishida S, Yamashita T, Imai K. Adenovirus-mediated transfer of the p53 family genes, p73 and p51/p63 induces cell cycle arrest and apoptosis in colorectal cancer cell lines: potential application to gene therapy of colorectal cancer. Gene Ther. 2001;8:1401-1408.  [PubMed]  [DOI]

16.	Takahashi A, Ohnishi K, Ota I, Asakawa I, Tamamoto T, Furusawa Y, Matsumoto H, Ohnishi T. p53-dependent thermal enhancement of cellular sensitivity in human squamous cell carcinomas in relation to LET. Int J Radiat Biol. 2001;77:1043-1051.  [PubMed]  [DOI]

17.	Gao N, Hu YD, Cao XY. The exogenous wild-type p14ARF gene induces growth arrest and promotes radiosensitivity in human lung cancer cell lines. J Cancer Res Clin Oncol. 2001;127:359-367.  [PubMed]  [DOI]

18.	Riva CM. Restoration of wild-type p53 activity enhances the sensitivity of pleural metastasis to cisplatin through an apoptotic mechanism. Anticancer Res. 2000;20:4463-4471.  [PubMed]  [DOI]

19.	Bampoe J, Glen J, Hubbard SL, Salhia B, Shannon P, Rutka J, Bernstein M. Adenoviral vector-mediated gene transfer: timing of wild-type p53 gene expression in vivo and effect of tumor transduction on survival in a rat glioma brachytherapy model. J Neurooncol. 2000;49:27-39.  [PubMed]  [DOI]

20.	Badie C, Bourhis J, Sobczak-Thepot J, Haddada H, Chiron M, Janicot M, Janot F, Tursz T, Vassal G. p53-dependent G2 arrest associated with a decrease in cyclins A2 and B1 levels in a human carcinoma cell line. Br J Cancer. 2000;82:642-650.  [PubMed]  [DOI]

21.	Dai J, Weinberg RS, Waxman S, Jing Y. Malignant cells can be sensitized to undergo growth inhibition and apoptosis by arsenic trioxide through modulation of the glutathione redox system. Blood. 1999;93:268-277.  [PubMed]  [DOI]

22.	Moriishi K, Huang DC, Cory S, Adams JM. Bcl-2 family members do not inhibit apoptosis by binding the caspase activator Apaf-1. Proc Natl Acad Sci USA. 1999;96:9683-9688.  [PubMed]  [DOI]

23.	Ahmed N, Laverick L, Sammons J. Effect of all-trans retinoic acid on chemotherapy induced apoptosis and down-regulation of Bcl-2 in human myeloid leukaemia CD34 positive cells. Leuk Res. 1999;23:741-749.  [PubMed]  [DOI]

24.	Zwata M, Harada K, Kono N, Kaneko S, Kobayashi K, Nakanuma Y. Expression of Bcl-2 familial proteins is reduced in small bile duct lesions of primary biliary cirrhosis. Hum Pathol. 2000;31:179-184.  [PubMed]  [DOI]

25.	Chou HK, Chen SL, Hsu CT, Chao YC, Tsao YP. Bcl-2 accelerates retinoic acid-induced growth arrest and recovery in human gastric cancer cells. Biochem J. 2000;348:473-479.  [PubMed]  [DOI]

26.	O'Reilly MA, Staversky RJ, Huyck HL. Bcl-2 family gene expression during severe hyperoxia induced lung injury. Lab Invest. 2000;80:1845-1854.  [PubMed]  [DOI]

27.	Liu HF, Liu WW, Fang DC, Men RP. Expression and significance of proapoptotic gene Bax in gastric carcinoma. World J Gastroenterol. 1999;5:15-17.  [PubMed]  [DOI]

28.	Hoetelmans R, van Slooten HJ, Keijzer R, Erkeland S, van de Velde CJ, Dierendonck JH. Bcl-2 and Bax proteins are present in interphase nuclei of mammalian cells. Cell Death Differ. 2000;7:384-392.  [PubMed]  [DOI]

29.	Liu HF, Liu WW, Fang DC, Liu FX, He GY. Clinical significance of Fas antigen expression in gastric carcinoma. World J Gastroenterol. 1999;5:90-91.  [PubMed]  [DOI]

30.	Zhang G, Tu C, Zhang G, Zhong G. Indomethacin induces apoptosis and inhibits proliferation in chronic myeloid leukemia cells. Leuk Res. 2000;24:385-392.  [PubMed]  [DOI]

31.	Deng Y, Wu X. Peg3/Pw1 promotes p53-mediated apoptosis by inducing Bax translocation from cytosol to mitochondria. Proc Natl Acad Sci USA. 2000;97:12050-12055.  [PubMed]  [DOI]

32.	Javelaud D, Besancon F. Inactivation of p21WAF1 sensitizes cells to apoptosis via an increase of both p14ARF and p53 levels and an alteration of the Bax/Bcl-2 ratio. J Biol Chem. 2002;277:37949-37954.  [PubMed]  [DOI]

33.	Mahyar-Roemer M, Roemer K. p21 Waf1/Cip1 can protect human colon carcinoma cells against p53-dependent and p53-independent apoptosis induced by natural chemopreventive and therapeutic agents. Oncogene. 2001;20:3387-3398.  [PubMed]  [DOI]

34.	Kobayashi N, Takada Y, Hachiya M, Ando K, Nakajima N, Akashi Ml. TNF-alpha induced p21(WAF1) but not Bax in colon cancer cells WiDr with mutated p53: important role of protein stabilization. Cytokine. 2000;12:1745-1754.  [PubMed]  [DOI]

35.	Loging WT, Reisman D. Elevated expression of ribosomal protein genes L37, RPP-1, and S2 in the presence of mutant p53. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 1999;8:1011-1016.  [PubMed]  [DOI]

36.	Horikoshi N, Cong J, Kley N, Shenk T. Isolation of differentially expressed cDNAs from p53-dependent apoptotic cells: activation of the human homologue of the Drosophila peroxidasin gene. Biochem Biophys Res Commun. 1999;261:864-869.  [PubMed]  [DOI]