Genistein 和PD98059对aFGF 及bFGF 诱导的CCL229细胞增生的抑制作用

doi:10.11569/wcjd.v11.i10.1646

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本文章的期刊信息

出版物名称

世界华人消化杂志

ISSN

1009-3079

本文章的出版商

Baishideng Publishing Group Inc, 7041 Koll Center Parkway, Suite 160, Pleasanton, CA 94566, USA

研究快报 Open Access

世界华人消化杂志. 2003-10-15; 11(10): 1646-1649
在线出版日期: 2003-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i10.1646

Genistein 和PD98059对aFGF 及bFGF 诱导的CCL229细胞增生的抑制作用

尚海, 张颐, 单吉贤

尚海, 辽宁省肿瘤医院肝胆胰外科辽宁省沈阳市 110042

张颐, 中国医科大学附属第一医院妇科辽宁省沈阳市 110001

单吉贤, 中国医科大学附属第一医院肿瘤外科辽宁省沈阳市 110001

通讯作者: 尚海, 110042, 辽宁省沈阳市大东区小河沿路44号, 辽宁省肿瘤医院. syzi@163.com

电话: 024-22711682

收稿日期: 2003-01-18
修回日期: 2003-01-30
接受日期: 2003-03-25
在线出版日期: 2003-10-15

摘要

目的

探讨酪氨酸蛋白激酶(TPK)抑制剂Genistein和细胞外信号调节激酶(ERK)激酶MEK抑制剂PD98059对酸性及碱性成纤维细胞生长因子(aFGF, bFGF)诱导的人大肠癌细胞株CCL229细胞增生的抑制作用．

方法

以不同浓度的aFGF或 bFGF刺激CCL229细胞, 再对由aFGF或 bFGF引起增生的细胞施加不同浓度的Genistein 或PD98059, 通过MTT比色法, 观察Genistein 及PD98059对细胞增生的抑制作用．

结果

aFGF和bFGF均可使该细胞株增生比明显增加, 而Genistein 和PD98059均可使该细胞株增生比明显下降, 其程度均随浓度增高而增强, 且Genistein的抑制作用强于PD98059．

结论

该细胞株中aFGF及bFGF受体有TPK活性, Genistein对aFGF及bFGF引起的细胞增生具有抑制作用, 且aFGF及bFGF可能通过激活TPK受体从而激活Ras-Raf-ERK信号传导途径来调控CCL229 细胞增生, PD98059可有效阻滞此传导途径．

关键词: N/A

引文著录: 尚海, 张颐, 单吉贤. Genistein 和PD98059对aFGF 及bFGF 诱导的CCL229细胞增生的抑制作用. 世界华人消化杂志 2003; 11(10): 1646-1649

N/A

Corresponding author: N/A

Received: January 18, 2003
Revised: January 30, 2003
Accepted: March 25, 2003
Published online: October 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

Citation: N/A. N/A. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2003; 11(10): 1646-1649
URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v11/i10/1646.htm
DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v11.i10.1646

0 引言

酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase, TPK)是一种催化蛋白质分子中酪氨酸残基磷酸化的蛋白激酶. 当生长因子与其受体结合后即可诱导受体TPK活性的激活, 从而使底物蛋白磷酸化, 调节细胞的分裂、增生[1], Ras-Raf-ERK为其下游信号传导途径之一. 本文应用TPK的特异性抑制剂Genistein及ERK激酶MEK抑制剂PD98059, 观察以上2种抑制剂对aFGF或 bFGF诱导的细胞增生的抑制作用, 进一步认识肿瘤细胞内的信号传导机制, 并为通过阻断信号传导途径而抑制肿瘤细胞增生提供依据．

1 材料和方法

1.1 材料

人大肠癌细胞系CCL229, 由中国医科大学细胞生物教研室提供. aFGF, bFGF购自北京邦定科技有限公司; Genistein、DMEM培养基、四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司; PD98059购自Promega公司; 二甲基亚砜(DMSO)为市售分析纯试剂. 酶联免疫检测仪为奥地利TACAN公司产品．

1.2 方法

1.2.1 细胞培养CCL229细胞在含100 mL/L小牛血清, 100 U/mL青霉素, 100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中贴壁生长, 于37 °C, 50 mL/L CO₂培养箱中传代培养．

1.2.2 实验分组 消化处于指数增生期的细胞, 以5×10³个细胞/孔接种于96孔板, 在37 °C, 50 mL/L CO₂及饱和湿度的条件下恒温密闭培养. 随机分组为: (1)空白对照组; (2)aFGF组, 观察aFGF对细胞的作用; (3)bFGF组, 观察bFGF对细胞的作用; (4)gen组, 观察genistein对细胞的作用; (5)PD组, 观察PD98059对细胞的作用; (6) aFGF+gen组, 观察aFGF和Genistein同时施加对细胞的作用; (7) bFGF+gen组, 观察bFGF和Genistein同时施加对细胞的作用; (8) aFGF +PD组, 观察aFGF和PD98059同时施加对细胞的作用; (9) bFGF+PD组, 观察bFGF和PD98059同时施加对细胞的作用．

1.2.3 施加因素 当细胞达到亚融合状态时, 吸出旧培养液, 每孔加入200 μL无血清培养液, 12 h后吸出旧培养液. 按分组要求加入肝素8 μL (2 μg/ μL), 不同量的aFGF, bFGF, Genistein, PD98059及培养液, 使各孔终体积均为200 μL. aFGF+ gen组, 细胞与Genistein温育30 min后加入aFGF; bFGF+ gen组, 细胞与Genistein温育30 min后加入bFGF; aFGF+PD组, 细胞与PD98059温育1 h加入aFGF; bFGF +PD组, 细胞与PD98059温育1 h加入bFGF. 各组具体剂量见表1．

表1 各组施加因素剂量.

分组	aFGF(mg/mL)				bFGF(ng/mL)				gen(mg/mL)				PD(mmol/L)
对照组	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
aFGF组	0.15	0.3	0.6	1.2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
bFGF组	0	0	0	0	25	50	75	100	0	0	0	0	0	0	0	0
gen组	0	0	0	0	0	0	0	0	6	12	24	48	0	0	0	0
PD组	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	50	100	150	200
aFGF+ gen组	0.6	0.6	0.6	0.6	0	0	0	0	6	12	24	48	0	0	0	0
bFGF+gen组	0	0	0	0	50	50	50	50	6	12	24	48	0	0	0	0
aFGF +PD组	0.6	0.6	0.6	0.6	0	0	0	0	0	0	0	0	50	100	150	200
bFGF +PD组	0	0	0	0	50	50	50	50	0	0	0	0	50	100	150	200

1.2.4 MTT比色 将96孔板放回孵箱, 2 d后倾出培养液, 每孔加MTT溶液(5 mg/mL) 20 μL. 继续孵育4 h, 每孔加入150 μL DMSO, 振荡10 min, 用酶联免疫检测仪读取每孔A值(测量波长620 nm, 参考波长490 nm). 绘制细胞生长曲线, 根据公式B/A ×100%计算细胞的增生、抑制率(A, B分别为对照组和实验组的光密度值). 实验重复3次, 每浓度均设3孔．

统计学处理 采用SPSS软件进行数据统计处理, P<0.05有统计学意义．

2 结果

2.1 aFGF和bFGF对CCL229细胞增生程度的影响

随aFGF及bFGF浓度升高, aFGF组及bFGF组增生比明显增加, 二者相比, bFGF组增生程度更明显(表2)．

表2 aFGF和bFGF对CCL229细胞增生的影响.

aFGF浓度(μg/mL)	bFGF浓度(ng/mL)	细胞A值	增生比(%)
0	0	0.802±0.004	100
0.15	0	0.855±0.017	107
0.3	0	1.017±0.031^a	127
0.6	0	1.093±0.009^a	136
1.2	0	1.211±0.025^a	151
0	25	1.055±0.032^a	132
0	50	1.318±0.041^a	164
0	75	1.412±0.027^a	176
0	100	1.486±0.021^a	185

^aP<0.05 vs 对照组.

2.2 genistein对CCL229细胞增生的抑制作用

随genistein浓度增加, gen组、aFGF+gen组及bFGF+gen组细胞增生比下降程度明显增加; genistein对bFGF引起的细胞增生抑制作用最强(P<0.05), 对aFGF引起的细胞增生抑制作用也强于gen组(表3)．

表3 genistein对aFGF或bFGF诱导的CCL229细胞增生的影响.

genistein浓度(mg/mL)	gen组		aFGF+gen组		bFGF+gen组
genistein浓度(mg/mL)	A值	增生比(%)	A值	增生比(%)	A值	增生比(%)
0	0.802±0.004	100	1.093±0.009	100	1.318±0.041	100
6	0.747±0.014^a	93	0.907±0.008^a	83	0.910±0.022^a	69
12	0.690±0.009^a	86	0.872±0.036^a	80	0.723±0.019^a	55
24	0.385±0.027^a	48	0.487±0.015^a	45	0.578±0.008^a	44
48	0.164±0.033^a	20	0.213±0.040^a	19	0.189±0.029^a	14

^aP<0.05 vs 对照组.

2.3 PD98059对CCL229细胞增生的抑制作用

加入PD98059后, PD组、aFGF+PD组及bFGF+PD组细胞增生比明显下降, 其下降程度随PD98089浓度增加而增加．三组比较, PD98089对bFGF诱导的细胞增生抑制作用最强(P<0.05), 其次为aFGF+PD组．

2.4 genistein和PD98059对CCL229细胞抑制作用的比较

genistein对CCL229细胞的抑制作用及对aFGF或bFGF诱导的CCL229细胞增生的抑制作用均强于PD98059 (P<0.05, 表3、表4)．

表4 PD98059对aFGF或bFGF诱导的CCL229细胞增生的影响.

PD98059浓度(mmol/L)	PD组		aFGF+PD组		bFGF+PD组
PD98059浓度(mmol/L)	A值	增生比 (%)	A值	增生比 (%)	A值	增生比 (%)
0	0.802±0.004	100	1.093±0.009	100	1.318±0.041	100
50	0.770±0.048	96	1.021±0.012^a	93	1.186±0.022^a	90
100	0.722±0.040^a	90	0.907±0.025^a	83	1.068±0.036^a	81
150	0.674±0.017^a	84	0.853±0.019^a	78	0.949±0.027^a	72
200	0.569±0.006^a	71	0.678±0.008^a	62	0.778±0.011^a	59

^aP<0.05 vs 对照组.

3 讨论

肿瘤细胞的侵袭、转移是一个多步骤、多因素的过程, 随着对细胞内信号传导途径研究的深入, 发现癌变与异常的细胞间信息传递密切相关[2-4]. 酪氨酸蛋白激酶信号系统是一条重要的信号传导途径. 许多生长因子受体具有TPK活性, 该蛋白激酶能以受体本身为底物, 发生自身磷酸化, 进而引起多种蛋白质的磷酸化, 与细胞增生密切相关[5-9]. 而Ras-Raf-ERK为其下游信号传导途径之一[10-12], 二者相辅相成, 相互作用, 共同完成细胞内信号传导过程．

本实验观察到aFGF和bFGF均可促进大肠癌细胞株CCL229的增生, 且随浓度升高, 作用加强. 加入TPK抑制剂genistein或ERK激酶MEK抑制剂PD98059后, 细胞增生明显受抑制, 随浓度升高, 抑制增强, 且genistein的抑制作用强于PD98059, 说明CCL229细胞的增生主要由TPK活化介导, Ras-Raf-ERK为其下游信号传导途径. 并且, aFGF+gen组及bFGF+gen组对细胞的抑制程度明显大于gen组, aFGF+PD组及bFGF+ PD组对细胞的抑制程度也明显大于PD组, 说明genistein及PD98059对aFGF和bFGF诱导的细胞增生具有更强的抑制作用．

研究已证实大肠癌中存在FGF及其受体的过度表达[13-18]. 本实验将为以阻断信号传导途径为靶点治疗大肠癌提供实验依据．

备注

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