端粒酶在大肠癌细胞中的活性表达及临床意义

摘要

目的

探讨端粒酶活性的改变在大肠癌发生发展过程中的作用以及端粒酶活性检测作为一种新的大肠癌临床诊断的生物学标志的可行性.

方法

采用TRAP(telomeric repeat amplification protocol)结合聚酰胺凝胶电泳银染法检测46例配对大肠癌及癌旁组织, 4例大肠癌肝转移病灶组织内端粒酶的活性, 并用Southern-blot-ECL (enhanced chemiluminescecce)法对上述标本内端粒酶平均长度进行检测.

结果

肿瘤组内端粒酶活性明显高于对应癌旁组织, 在肿瘤组织内, 端粒酶的活性表达升高与大肠癌的病理学分期呈显著相关性(P<0.01, t = 8.3477), 而与肿瘤的大小、部位, 肿瘤的恶性程度、分级、浸润深度、CEA表达水平等无显著相关性, 与肿瘤组相比, 在肝转移病灶内, 端粒酶的活性表达无显著升高, 肿瘤组内的端粒酶平均长度明显大于对应的癌旁组织. 端粒酶平均长度与大肠癌的病理学分期呈显著相关性.

结论

端粒酶的活化及其长度的缩短可能成为早期检测大肠癌癌变的临床指标.

关键词: N/A

N/A

N/A

Corresponding author: N/A

Received: January 15, 2003
Revised: March 20, 2003
Accepted: March 28, 2003
Published online: October 15, 2003

Abstract

N/A

Key Words: N/A

0 引言

大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率均有上升趋势, 大肠癌的早期诊断尚缺乏有效的临床指标. 近年来, 端粒酶在细胞衰老和癌变过程中的作用已受到人们的重视. 研究者普遍认为, 端粒酶的激活是肿瘤形成过程中的关键步骤, 为了进一步明确端粒酶的激活与在大肠癌形成发展过程中的确切作用, 我们对46例配对大肠癌及癌旁组织, 4例大肠癌肝转移病灶组织内端粒酶的活性及端粒酶平均长度进行了检测.

1 材料和方法

1.1材料

46例配对大肠癌及癌旁组织, ４例大肠癌肝转移病灶组织均取自2000-01/2000-12我院住院手术的患者. 其中, 癌旁组织均取自肿瘤切除标本的远癌断端, 所有标本均于手术切除术后20 min内取材, 并迅速置-180 °C液氮内冻存待用.

1.2 方法

1.2.1 端粒酶活性检测 严格按端粒反复扩增法(telomeric amplification protocol)试剂盒说明书进行操作. (1)组织提取液的制备: 从液氮中取出冻存组织500 mg, 剪碎, 清洗, 离心, 弃上清, 组织匀浆器将组织制成匀浆, 加组织裂解液, 离心, 上清经蛋白定量后液氮中保存待用. (2)合成TS和CX引物, (3)建立TRAP反应体系(50 μL), 反应参数如下: 引物延伸25 °C 30 min, 端粒酶灭活94 °C 5 min. 扩增: 变性94 °C 30 s, 退火50 °C 30 s, 延伸72 °C 90 s, 循环30次, 延伸72 °C 10 s, 4 °C抑制.

1.2.2 聚丙烯凝胶电泳, 增强化学发光法(ECL)显影 取25 μL上述PCR产物, 于120 g/L非变性聚丙烯凝胶电泳, ECL显影. 分子量标记物为pBR322 DNA/HaeIII Markers.

1.2.3 端粒酶末端限制性片段长度测定 采用经典法提取组织DNA, 根据260 nm处的吸收光值计算基因组DNA浓度, 取2.5 μg DNA并建立限制性内切酶消化体系, HinfI/RsaI联合酶切, 琼脂糖凝胶电泳, Southern blot印迹转膜, 与生物素标记的端粒探针进行杂交, ECL法显影. 胶片上杂交信号经光密度扫描仪(美国Bromma公司LKB2400Gelescan XL)检测2-23 kb间吸收光度Ａ值, 按公式计算出各样本DNA平均端粒长度．

统计学处理t 检验．

2 结果

2.1 端粒酶在大肠癌

配对癌旁组织及大肠癌肝转移组织内的表达以PCR产物电泳后见到条带间相差６bp的梯形条带为阳性(出现三条以上条带), 根据上述判断标准, 46例大肠癌组织中, 41例端粒酶表达阳性, 阳性率89.13％, 而配对的癌旁组织中, 端粒酶表达全部为阴性, 两组之间具有极显著性差异(P<0.05), 在肿瘤组内, 17例Dukes A-B期肿瘤组织中, 13例端粒酶表达阳性, 阳性率为76.47％, 29例Dukes C-D期肿瘤组织中, 28例端粒酶表达阳性, 阳性率为96.55％, Dukes C-D期的阳性率显著高于Dukes A-B期(P<0.001), ４例大肠癌肝转移病灶内端粒酶表达全部阳性．因例数太少, 不宜与配对肿瘤组织进行显著性分析; 端粒酶阳性表达与肿瘤的大小、部位、性别、浸润深度、组织学类型及分化程度等病理学指标无显著相关性．

2.2 46例大肠癌组织中不同位点端粒的平均长度

肿瘤组端粒的平均长度为4.4±1.1 kb, 癌旁组的平均长度为9.6±1.5 kb, 两组间具有显著差异(P<0.001)．

2.3 46例大肠癌组织不同临床分期与端粒长度的关系

实验结果表明, 随着肿瘤分期的下降, 端粒的长度显著下降(t = 8.3477, P<0.01, 表1), 端粒的长度与其他临床病理学指标无明显相关性.

表1 直肠癌瘤的Dukes分期与端粒长度的关系(mean±SD, kb).

Dukes分期	n	端粒长度
Dukes A-B	17	6.6±1.2
Dukes C-D	29	3.7±1.1

3 讨论

染色体端粒是位于染色体末端的一种特殊结构, 由串联的短片序列和蛋白组成, 在染色体的定位、复制及保护方面起重要作用[1], 端粒序列的复制依赖于端粒酶的作用, 正常体细胞中通常无该酶的表达, 随着细胞有丝分裂次数的增加, 端粒片段的长度不断缩短, 细胞即进入程序化死亡, 端粒的长度被认为是细胞有丝分裂的时钟[2]. 自1994年以来, 国外研究表明, 85％以上的肿瘤细胞呈端粒酶表达阳性, 而正常组织中却检测不到端粒酶的活性. 细胞提示这一分子事件与肿瘤细胞的恶性转化及肿瘤细胞的持续分裂增殖的相关性, 同时有力的提示端粒酶的活性可作为肿瘤检测的一个特异性指标.

我们的实验结果表明, 46例大肠癌组织中, 41例端粒酶表达阳性, 阳性率89.13％, 而配对的癌旁组织中, 端粒酶表达全部为阴性, 两组之间具有极显著性差异(P <0.05), 与国外其他学者的研究结果接近[3-10], 同时, 肿瘤组内端粒序列的长度显著低于配对的癌旁组, 说明端粒的缩短和端粒酶的激活间存在着某种平衡, 这种平衡的维持, 使肿瘤细胞获得无限增生的能力.

在肿瘤组内, 17例Dukes A-B期肿瘤组织中, 13例端粒酶表达阳性, 阳性率为76.47％, 29例Dukes C-D期肿瘤组织中, 28例端粒酶表达阳性, 阳性率为96.55％, Dukes C-D期的阳性率显著高于Dukes A-B期(P<0.01), 同时, Dukes C-D期的端粒长度显著低于Dukes A-B期(P<0.05), 这说明, 晚期肿瘤中, 由于细胞分裂次数的增加, 进入死亡临界点的细胞数增加, 端粒的长度越来越短, 端粒酶被激活的数量增加.其他学者的实验结果表明[11], 在早期神经母细胞瘤中, 端粒酶的表达较高, 而在晚期表达较低, 另外, 我们收集的４例大肠癌肝转移病灶内端粒酶表达全部阳性. 因例数太少, 不宜与配对肿瘤组织进行显著性分析, 尚不能说明端粒的表达与大肠癌肝转移之间的相关性, 但已有报道表明, 端粒酶的活性与肿瘤的转移特性有密切的关系[12], 到目前为止, 这种现象的原因还不清楚, 需进一步扩大样本进行深入研究.

实验结果表明, 端粒酶的活性及端粒序列的长短与大肠癌患者的年龄、组织学类型、浸润深度等病理学指标无显著相关性, 这与其他学者的研究结果相似[13,14].这说明, 端粒的缩短和端粒酶的激活只是肿瘤恶变的一个必要条件, 而肿瘤细胞的分裂速度、侵袭及转移特性可能与细胞内其他调节机制有关.

端粒酶作为肿瘤诊断的标记物的希望已展现出光辉的前景, 已有不少学者对大肠癌患者粪便中脱落细胞进行了端粒酶活性检测, 特异性达到95.7％, 阳性预测值达到96.4％, 充分说明了端粒酶作为大肠癌诊断标记物的有效性和潜在的应用价值[15]. 此外, 也有人提出研制端粒酶抑制剂用于治疗恶性肿瘤, 但是端粒酶在细胞永生化过程中发挥作用的机制仍有待进一步研究. 因此, 将端粒酶真正用于临床, 还需要做大量基础和临床研究工作.

备注

$[Footnotes]

参考文献

1.	Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 1994;266:2011-2015.  [PubMed]  [DOI]

2.	Haber DA. Telomeres, cancer, and immortality. New Engl J Med. 1995;332:955-956.  [PubMed]  [DOI]

3.	Tahara H, Kuniyasu H, Yokozaki H, Yasui W, Shay JW, Ide T, Tahara E. Telomerase activity in preneoplastic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clinical Cancer Res. 1995;1:1245-1251.  [PubMed]  [DOI]

4.	Tatsumoto N, Hiyama E, Murakami Y, Imamura Y, Shay JW, Matsuura Y, Yokoyama T. High telomerase activity is an independent prognostic indicator of poor outcome in colorectal cancer. Clinical Cancer Res. 2000;6:2696-2701.  [PubMed]  [DOI]

5.	Chadeneau C, Hay K, Hirte HW, Gallinger S, Bacchetti S. Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer. Cancer Res. 1995;55:2533-2536.  [PubMed]  [DOI]

6.	Hastie ND, Dempster M, Dunlop MG, Thompson AM, Green DK, Allshire RC. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. Nature (Lond). 1990;346:866-868.  [PubMed]  [DOI]

7.	Hiyama E, Gollahan L, Kataoka T, Kuroi K, Yokoyama T, Gazdar AF, Hiyama K, Piatyszek MA, Shay JW. Telomerase activity in human breast tumors. J Natl Cancer Inst. 1996;88:116-122.  [PubMed]  [DOI]

8.	Hiyama K, Hirai Y, Kyoizumi S, Akiyama M, Hiyama E, Piatyszek MA, Shay JW, Ishioka S, Yamakido M. Activation of telomerase in human lymphocytes and hematopoietic progenitor cells. J Immunol. 1995;155:3711-3715.  [PubMed]  [DOI]

9.	Hiyama K, Hiyama E, Ishioka S, Yamakido M, Inai K, Gazdar AF, Piatyszek MA, Shay JW. Telomerase activity in small-cell and non-small-cell lung cancers. J Natl Cancer Inst. 1995;87:895-902.  [PubMed]  [DOI]

10.	Counter CM, Hirte HW, Bacchetti S, Harley CB. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91:2900-2904.  [PubMed]  [DOI]

11.	Hiyama E, Hiyama K, Yokoyama T, Matsuura Y, Piatyszek MA, Shay JW. Correlating telomerase activity levels with human neuroblastoma outcomes. J Neture Med. 1995;1:249-255.  [PubMed]  [DOI]

12.	Engelhardt M, Drullinsky P, Guillem J, Moore MA. Telomerase and telomere length in the development and progression of premalignant lesions to colorectal cancer. J Clinical Cancer Res. 1997;3:1931-1941.  [PubMed]  [DOI]

13.	Ohta K, Kanamaru T, Yamamoto M, Saitoh Y. Clinical significance of telomerase activity in hepatocellular carcinoma. Kobe J Med Sci. 1996;42:207.  [PubMed]  [DOI]

14.	Rogalla P, Rohen C, Bonk U, Bullerdiek J. Telomeric repeat fragment lengths are not correlated to histological grading in 85 breast cancers. Cancer Lett. 1996;106:155-161.  [PubMed]  [DOI]

15.	骆 成玉, 李 世拥, 李 鸿义, 赵 丹宁, 曲 军, 祝 学光. 大肠癌患者粪便标本的端粒酶活性研究. 中华外科杂志. 2001;39:580-582.  [PubMed]  [DOI]