胃癌 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2003-01-15; 11(1): 10-13
在线出版日期: 2003-01-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i1.10
胃癌细胞nm23H1基因表达与体内外侵袭力的关系
孙秀菊, 孙开来, 付浩, 王舒宝, 陈峻青
孙秀菊, 孙开来, 付浩, 中国医科大学分子遗传教研室 辽宁省沈阳市 110001
王舒宝, 陈峻青, 中国医科大学第一临床学院肿瘤科 辽宁省沈阳市 110001
孙秀菊, 女, 1965-09-19生, 辽宁省大连市人, 汉族, 1999年于中国医科大学获博士学位. 现为副教授, 主要从事胃癌分子机制的研究.
基金项目: 国家"973"项目(国家重点基础研究发展规划项目)"恶性肿瘤发生与发展的基础性研究"子项目课题, No. G1998051203.
通讯作者: 孙开来, 110001, 辽宁省沈阳市, 沈阳中国医科大学分子遗传教研室. klsun@vip.sina.com
电话: 024-23265842 传真: 024-23265842
收稿日期: 2002-06-01
修回日期: 2002-06-25
接受日期: 2002-07-26
在线出版日期: 2003-01-15

目的: 探讨nm23H1基因与胃癌细胞体内外侵袭力的关系.

方法: 采用Boyden小室法测定四种胃癌细胞系MKN1、MKN45、GT3TKB、BGC823的体外侵袭力, Northern印记杂交, RT-PCR及免疫组化技术检测胃癌组织、四种胃癌细胞系的nm23H1 mRNA及蛋白表达水平.

结果: 胃癌细胞体外侵袭力高低的顺序依次为MKN45最高(33.1±5.2, 与其他三种细胞系相比, P<0.01); BGC823(15.8±2.7), MKN1(14.1±4.5)次之(二者无显著差异, P>0.05), GT3TKB最低(6.3±2.5, 与其他三种细胞系相比, P<0.01). nm23H1 基因表达与胃癌细胞体内侵袭能力呈反比关系; nm23H1基因表达与MKN45, BGC823, GT3TKB细胞体外侵袭力也呈反比关系, 但与MKN1细胞体外侵袭力无明显关系.

结论: nm23H1表达在评价胃癌细胞体内外侵袭力方面具有重要价值.

关键词: N/A

引文著录: 孙秀菊, 孙开来, 付浩, 王舒宝, 陈峻青. 胃癌细胞nm23H1基因表达与体内外侵袭力的关系. 世界华人消化杂志 2003; 11(1): 10-13
Relationship between expression of nm23H1 gene and in vivo and in vitro invasive capacity of gastric cancer cells
Xiu-Ju Sun, Kai-Lai Sun, Hao Fu, Shu-Bao Wang, Jun-Qing Chen
Xiu-Ju Sun, Kai-Lai Sun, Hao Fu, Department of Molecular Genetics, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Shu-Bao Wang, Jun-Qing Chen, Department of Oncology, The First Clinical College, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China
Supported by: the National "973"Project(National key program on basic research)No. G19980501203.
Correspondence to: Kai-Lai Sun, Department of Molecular Genetics, China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. klsun@vip. sina. com
Received: June 1, 2002
Revised: June 25, 2002
Accepted: July 26, 2002
Published online: January 15, 2003

AIM: To explore the relationship between the expression of nm23H1 gene and the in vivo and in vitro. invasive capacity of gastric cancer cells

METHODS: The invasive capacity of gastric cancer cell in vitro was determined by Boyden chamber method. And the expressions of nm23H1 in gene and protein level were measured by Northern Blot, RT-PCR and immunohistochemical method in gastric cancer cell lines, respectively.

RESULTS: The order of the invasive capacity of gastric cancer cell lines were: MKN45, being the highest(33.1±5.23, P<0.01); BGC823(15.8±2.7) and MKN1(14.1±4.5), the moderate(there was no significant difference between them, P>0.05), and GT3TKB(6.3±2.5), the lowest(P<0.01). The expression of nm23H1 gene was negatively correlated with the in vivo invasive capacity of gastric cancer cell lines, and also negatively correlated with the in vitro invasive capacity of gastric cancer cell lines of MKN45, BGC823 and GT3TKB. But there was no relationship between the expression of nm23H1 gene and the invasive capacity of MKN1 in vitro.

CONCLUSION: The expression of nm23H1 gene is of great significance in evaluating the in vivo and in vitro invasive capacity of gastric cancer cell lines.

Key Words: N/A


0 引言

肿瘤侵袭、转移是目前研究的一个热点问题[1-6]. 由于胃癌严重威胁人类健康, 近年来对胃癌侵袭、转移分子机制的研究日趋深入[7-13], 作为一种重要的肿瘤转移抑制基因, nm23基因与胃癌关系的研究报道较多, 但目前关于nm23H1基因与胃癌细胞体内外侵袭力关系的研究, 国内外报道甚少. nm23H1基因是 nm23基因家族的重要成员, 将该基因转染肝癌细胞可使其转移能力明显降低[14,15]. 他影响细胞的运动、黏附等特性, 调节肿瘤细胞侵袭转移能力. 我们采用Boyden 小室法测定不同胃癌细胞的体外侵袭力, 分析nm23H1表达与胃癌细胞体内外侵袭力的关系, 为认识胃癌侵袭转移的分子机制提供有价值的实验依据.

1 材料和方法
1.1 材料

收集中国医科大学第一临床学院肿瘤科1997-01/1998-04胃癌手术切除标本, 其中新鲜组织标本24例, 术中取材, 置液氮中速冻10 min, 然后-70 ℃冰箱中保存, 用于mRNA检测; 石蜡标本(胃癌组织62例)连续5 mm切片每例3张, 分别进行HE染色及免疫组化染色. 切除标本均进行病理学系统检查. 胃癌细胞系MKN1, MKN45, GT3TKB由日本理化研究所横山和尚教授惠赠, BGC823细胞由中国医科大学肿瘤所提供; NIH3T3细胞由中国医科大学细胞生物实验室提供. MKN45及 BGC823细胞均来源于低分化腺癌, GT3TKB来自黏液细胞癌, MKN1具有向腺瘤和鳞状上皮细胞双向分化的潜能. 微孔滤膜(8 mm)、基底膜胶和Boyden Chamber均由中国医学科学院肿瘤所免疫室罗利群老师惠赠.

1.2 方法

MKN1, MKN45, BGC823细胞培养基为RPMI1640, GT3TKB及NIH3T3细胞培养基为DMEM, 二者均含青链霉素及100 ml/L小牛血清, 37 ℃恒温密闭式CO2培养箱培养. 侵袭实验参照Albin et al(Cancer Res, 1987; 47: 3239) 方法, 计数侵入滤膜的细胞数. 共计数中央和四周各5个视野, 每种细胞重复三次实验, 取平均值(n = 30). 将生长旺盛的胃癌细胞用胰酶消化, 制成密度为1×108/L的悬液, 接种于直径10 cm培养皿中, 皿内预置盖玻片, 常规培养72 h, 吸去培养液, 1×PBS清洗细胞, 加40 g/L甲醛固定, 待免疫组化染色.

1.2.1 Northern-印记杂交: 根据GenBank nm23H1 基因序列, 在nm23H1基因3'非翻译区(与nm23H2非同源区)设计引物, 采用PCR方法合成探针. 引物序列为F: 5'GCAGACCACATTGCTTTTCA3'; R: 5'CAGGGAGAACTCACAGCTCC 3'; 片段长度为134 bp. 采用 GIBCOBRL公司总 RNA提取试剂Trizol Reagent提取总 RNA, 在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行RNA电泳, 而后将RNA转移到尼龙膜上. 采用Promega公司随机引物试剂盒进行探针标记. 杂交条件参照《分子克隆》. 采用Luzex-F半自动图像分析仪定量分析杂交信号强度, nm23H1灰度值指数 = nm23H1灰度值: β-actin灰度值, nm23H1mRNA含量与其灰度值指数呈反比关系.

1.2.2 RT-PCR方法: 提取总RNA, 反转录合成cDNA(按试剂盒说明书进行), 然后进行PCR扩增. PCR反应体积为25 mL. nm23H1引物序列: F: 5'GTGAAAAGCAATGTGGT3'R: 5'TTGCCATGGTCTGGGAG3'产物长度267bp. b-actin引物序列: F: 5'GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3'R: 5'CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3'产物长度513 bp. PCR反应条件: 94 ℃变性5 min后, 以94 ℃ 30 s 、 50 ℃ 30 s 、72 ℃ 40 s的顺序循环35次, 最后72 ℃延伸7 min. PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳1 h, 凝胶置GDS 8 000凝胶自动成像仪中, 采用Gels Work-ID软件检测各条带强度, nm23H1指数 = nm23H1值/β-actin值. nm23H1指数与其mRNA表达呈正比关系.

1.2.3 免疫组化染色法: 鼠抗人nm23H1单克隆抗体NM301(Santa cruz产品). 过氧化酶标记的链霉卵白素(streptavidin peroxidase, SP)免疫组化染色试剂盒(北京中山生物技术公司产品). nm23H1蛋白采用SP法染色(AEC显色), 染色步骤按试剂盒说明书进行, 以PBS代替一抗作阴性对照. 免疫组化结果判定: 细胞内出现桔红色颗粒为nm23H1阳性细胞. 组织标本中nm23H1蛋白表达参照Shimizu et al(Hum Pathol, 1990; 21: 607)方法进行评定和积分, 2分及2分以下为阴性, 3分及3分以上为阳性. 胃癌细胞nm23H1蛋白表达水平采用Luzex-F半自动图像分析仪定量分析, 每种细胞取2张切片, 每张切片各测5个相同单位面积的灰度值, nm23H1蛋白含量与其灰度值呈反比关系.

统计学处理 采用t检验、x2检验. P<0.05具有统计学意义.

2 结果
2.1 nm23H1基因表达与胃癌浸润深度的关系

RT-PCR及免疫组织化学分析结果显示, 浸透浆膜的胃癌组织中nm23H1 mRNA及蛋白表达水平显著低于未透浆膜者, 表明nm23H1 mRNA及蛋白表达水平与胃癌浸润深度有关(表1). 为进一步验证RT-PCR研究结果, 我们又采用Northern-印记杂交检测了8例胃癌中nm23H1 mRNA表达水平, 结果表明, 浸透浆膜的胃癌中nm23H1 mRNA杂交信号灰度值指数(1.74±0.22)显著高于未透浆膜者(0.84±0.19, P<0.05), 与RT-PCR结果一致(图1).

表1 nm23H1 mRNA及蛋白表达与胃癌浸润深度的关系.
浸润深度nnm23H1 mRNA指数(x±s)nnnm23H1蛋白阳性率(%)
未透浆膜70.49±0.16a282175.0b
浸透浆膜170.27±0.2334720.6
图1
图1 Northern-印记杂交检测胃癌组织中nm23H1 mRNA表达. A: nm23H1 mRNA; B: β-actin Mrna. T1: 浸透浆膜; T2, T3: 未浸透浆膜.
2.2胃癌细胞系体外侵袭力的测定

体外侵袭力以侵入滤膜的细胞数来判定, 在所检测的四种胃癌细胞系中, MKN45侵袭力最高, MKN1 和BGC823的侵袭力(侵入滤膜细胞数)均低于MKN45(MNK1 14.1±4.5 vs MKN45 33.1±5.2; BGC823 15.8±2.7 vs MKN 33.1±5.2, P<0.01), 但MKN1和BGC823的侵袭力无显著差异(P>0.05), GT3TKB(6.3±2.5)侵袭力又低于MKN1 和BGC823(P<0.01), 其侵袭力最低.

2.3 nm23H1 mRNA和蛋白表达与胃癌细胞体外侵袭力的关系

四种胃癌细胞系nm23H1mRNA及蛋白质水平检测的结果一致表明, MKN45显著低于BGC823(P<0.02), BGC823又低于GT3TKB(P<0.005), 而MKN1与GT3TKB的nm23H1 mRNA及蛋白质表达无显著差异(P>0.05)(表2, 图2-4); 侵袭力高低的顺序为: MKN45最高, BGC823、MKN1次之, GT3TKB最低. 可见MKN45、 BGC823 、GT3TKB nm23H1基因表达与其体外侵袭力呈反比关系, 但相比之下MKN1nm23H1基因表达与其体外侵袭力无明显关系.

表2 胃癌细胞nm23H1 mRNA及蛋白表达(mean±SD).
细胞系nm23H1指数(n = 5)nm23H1灰度值(n = 10)
MKN450.28±0.05143.9±3.5
BGC8230.49±0.07104.4±1.2
GT3TKB1.06±0.1091.8±3.3
MKN11.16±0.1591.4±3.1
图2
图2 胃癌细胞nm23H1mRNA RT-PCR检测结果. nm23H1 : 267bp; 内对照b-actin: 513 bp M: DNA Marker.
图3
图3 胃癌细胞MKN45 nm23H1蛋白表达(S-P×400).
图4
图4 胃癌细胞GT3TKB nm23H1蛋白表达(S-P×400).
3 讨论

作为一种转移抑制基因, nm23倍受关注. 许多研究表明, nm23基因表达水平与乳腺癌、结肠直肠癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、喉鳞状细胞癌、鼻咽癌、甲状腺癌等肿瘤侵袭转移呈显著负相关[16-24], 且nm23基因低表达患者的生存期短、预后不良. nm23基因与胃癌的研究报道不一, 有的研究表明胃癌中nm23低表达与胃癌肝转移、淋巴结转移及胃癌的浸润深度呈负相关[25,26] ; 另一些学者报道认为胃癌组织nm23基因 表达与胃癌侵袭、淋巴结转移及血行转移呈正相关[27-31], Lee et al[32,33] 报道胃癌组织nm23 基因表达与胃癌预后无明显关系, 可见nm23与胃癌关系的研究结果不一. 产生这些差异的一个重要原因, 就是其检测方法不能有效区分nm23H1与 nm23H2. 有的研究采用nm23多克隆抗体, 他与nm23H1、 nm23H2蛋白均可结合, 有的研究则采用nm23H1单克隆抗体, 只与nm23H1反应, 因此他们检测的分子有所不同; 由于nm23H1 、nm23H2 mRNA具有很高的同源性, 因此如应用nm23H1全长cDNA探针进行Northern blot检测mRNA表达, 则很难特异检测nm23H1 mRNA表达水平. 因此有必要采用针对nm23H1 、nm23H2特异的抗体或探针分别研究他们的表达与胃癌的关系, 将会对nm23基因与胃癌的关系有更准确的认识. 我们采用nm23H1特异的方法, 系统的研究nm23H1表达与胃癌细胞体内外侵袭力的关系, 而这方面的研究目前尚未见报道.

本研究中Northern blot所用探针位于nm23H1的3'非翻译区内, 此序列与nm23H2同源性很低, 可与nm23H1特异性结合; RT-PCR引物亦可特异扩增nm23H1, 免疫组化采用的抗体为nm23H1特异性单克隆抗体, 与nm23H2无交叉反应, 可特异性检测nm23H1基因的表达. 我们同时从mRNA和蛋白质二个水平检测胃癌有关组织标本nm23H1的表达, 结合临床资料进行分析表明, 胃癌nm23H1 mRNA及蛋白水平与胃癌浸润深度呈负相关.

肿瘤细胞侵袭基底膜是发生转移的关键步骤, 测定肿瘤细胞侵袭人工基底膜的能力, 可以间接反映肿瘤细胞体内侵袭转移能力, 具有重要意义. 在了解nm23H1表达与胃癌细胞体内侵袭力关系的基础上, 采用Boyden小室法测定了四种胃癌细胞系的体外侵袭力, 并观察了nm23H1表达与胃癌细胞体外侵袭力的关系. 本研究采用RT-PCR及免疫组化技术分别检测了四种胃癌细胞系nm23H1 mRNA及蛋白表达水平, 结果表明MKN45、 BGC823 、GT3TKB nm23H1基因表达与体外侵袭力呈明显负相关. 可见nm23H1基因可抑制胃癌细胞体内外侵袭能力. 关于nm23H1基因抑制肿瘤细胞侵袭转移的机制, 已为其他学者证实. 将nm23H1基因转染口腔鳞状细胞癌细胞系后, 细胞运动能力显著降低, 但转染前后其基质金属蛋白水解酶水平无明显差异; 甲基化抑制剂抑制nm23H1基因启动子CpG岛甲基化, 使乳腺癌细胞中nm23H1表达增高, 细胞运动能力显著降低, 可见nm23H1通过抑制细胞运动能力而降低其侵袭转移能力[34,35]. 近期对nm23基因的研究不断深入, 研究表明nm23H1负向调控转移相关基因Tiam1, 抑制体内Rac1的激活而发挥抑制侵袭转移的作用[36] ; EB病毒核蛋白EBNA-3C逆转nm23H1蛋白抑制淋巴瘤细胞和乳腺癌细胞运动的能力[37] ; 雌激素与其受体相互作用后可激活nm23H1基因转录而抑制肿瘤转移[38]. 可见nm23H1基因与其他基因之间相互作用而发挥其抑制转移的功能.

本实验还发现胃癌细胞MKN1中nm23H1基因表达与其体外侵袭力不呈明显相关. 分析原因我们认为与其细胞本身的生物学特性有关, 因为他具有向腺瘤和鳞状上皮细胞双向分化的潜能, 因而其侵袭转移的调控机制更为复杂. 另外肿瘤细胞侵袭转移本身受到多种基因的调控, 如与其他转移相关基因结合分析, 将会更客观地评价肿瘤细胞的侵袭转移能力. 总之, 我们的研究证明nm23H1基因表达在评价胃癌细胞体内外侵袭力方面具有重要价值.

编辑: N/A

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