基础研究
Copyright ©The Author(s) 2012. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2012-07-08; 20(19): 1705-1712
Published online 2012-07-08. doi: 10.11569/wcjd.v20.i19.1705
人突变型CDK4真核荧光表达质粒的构建及对人肝细胞SMMC-7702中POLD1基因表达的调控
李永继, 黄怡, 阮细玲, 廖柳凤, 吴琼, 黄文涛, 徐恒
李永继, 阮细玲, 广西医科大学第一附属医院病理科 广西壮族自治区南宁市 530021
黄怡, 廖柳凤, 吴琼, 黄文涛, 广西医科大学第一附属医院药理学教研室 广西壮族自治区南宁市 530021
徐恒, 广西医学科学实验中心肿瘤实验室 广西壮族自治区南宁市 530021
李永继, 在读硕士, 主要从事肝癌、乳腺癌中POLD1/P125与细胞周期蛋白复合物调控通路及其致癌机制的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30672363; 广西医科大学实验中心开放课题基金资助项目, No. 903011306; 广西医科大学研究生创新课题基金资助项目, No. 2010105981001M227.
作者贡献分布: 实验设计、质粒构建、细胞增殖检测、荧光定量PCR和Western blot等主要实验、数据分析和文章撰写由李永继完成; 部分细胞培养、质粒转染等由阮细玲、黄怡、廖柳凤、黄文涛及吴琼协助完成; 部分数据分析由黄怡完成; 课题指导、文章修改和审阅由徐恒完成.
通讯作者: 徐恒, 教授, 530021, 广西壮族自治区南宁市双拥路22号, 广西医科大学医学实验中心肿瘤实验室. heng6888@yahoo.com
收稿日期: 2012-03-15
修回日期: 2012-05-03
接受日期: 2012-06-02
在线出版日期: 2012-07-08
Abstract

目的: 构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体, 作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型, 研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制, 为干预细胞恶性增殖提供新的思路.

方法: 设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行PCR扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA, 以pEGFP-C1质粒为模板连接, 得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析; 转染细胞分3组: 实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4), 阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702). 通过MTT试验分析细胞增殖变化; 实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量, Western blot检测蛋白表达的差异.

结果: 成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4, 转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的CDK4蛋白; SMMC-7721细胞中突变型的CDK4存在5个碱基突变, 4个碱基插入, 2个碱基缺失, 这使得5个氨基酸序列发生了改变; 与空白对照组及阴性对照组相比, 实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08 vs 0.596±0.06, 0.609±0.10, F = 7.033, 均P<0.05); 实验组CDK4 mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11 vs 1.01±0.00, 1.05±0.12, F = 54.046, P<0.01), POLD1 mRNA相应地升高(2.47±0.25 vs 1.16±0.00, 1.26±0.23, F = 135.496, P<0.01); 稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同, 其中实验组CDK4(0.65±0.03 vs 0.41±0.03, 0.39±0.05, F = 14.665, 均P<0.05), P125(0.54±0.04 vs 0.30±0.07, 0.25±0.06, F = 11.788, 均P<0.05).

结论: 人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力, 这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.

Keywords: 肝细胞癌; 突变; CDK4; POLD1