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世界华人消化杂志. 2009-10-18; 17(29): 2996-3000
Published online 2009-10-18. doi: 10.11569/wcjd.v17.i29.2996
Published online 2009-10-18. doi: 10.11569/wcjd.v17.i29.2996
幽门螺杆菌γ谷氨酰转肽酶同源基因的表达与活性检测
孔梅, 张尤历, 陈鑫, 陈慧娟, 江苏大学附属医院消化科 江苏省镇江市 212001
孔梅, 在读硕士, 主要从事消化系疾病的临床和基础研究.
作者贡献分布: 孔梅与张尤历对此文所作贡献均等; 此课题由孔梅、张尤历、陈鑫及陈慧娟设计; 研究过程由孔梅、陈鑫及陈慧娟操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由张尤历提供; 数据分析由孔梅、张尤历、陈鑫及陈慧娟完成; 本论文写作由孔梅与张尤历完成.
通讯作者: 张尤历, 教授, 212001, 江苏省镇江市, 江苏大学附属医院消化科. zjyouli@yahoo.com.cn
电话: 0511-85021787
收稿日期: 2009-08-18
修回日期: 2009-09-23
接受日期: 2009-10-12
在线出版日期: 2009-10-18
修回日期: 2009-09-23
接受日期: 2009-10-12
在线出版日期: 2009-10-18
Abstract
目的: 评价幽门螺杆菌(H. pylori)ggt同源基因的结构特征和功能.
方法: 通过生物信息学软件分析H. pylori γ谷氨酰转肽酶(ggt)同源基因产物的结构特征; 提取H. pylori DNA, 并以之为模板, 采用PCR法扩增该基因的全长及去信号肽片段; 进行序列分析后, 将全长片段与gfp片段连接, 分别克隆进杆状病毒的转移质粒pFastBac1中, 利用杆状病毒的Bac-to-Bac系统分别获得重组杆状病毒的DNA; 通过PCR方法验证这些片段克隆进杆状病毒; 将重组病毒的DNA以脂质体为媒介转染家蚕细胞, 以获得重组杆状病毒; 分别收集这些重组病毒, 并再感染家蚕细胞, 进行蛋白表达实验和活性检测, 以荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的分布.
结果: 通过PCR方法成功克隆了各种片段; 测序的结果表明, 未发生突变; 基因片段扩增的结果说明, 获得了3种重组的杆状病毒, 且这3种重组病毒均表达了ggt片段, 全长、去信号肽片段及去信号肽片段与gfp融合的片段的表达产物活性分别为3.61, 10.50及9.31 U/L. Western blot的结果证实了去信号肽片段与GFP的融合表达. 通过荧光显微镜观察去信号肽与gfp的融合片段的表达产物在细胞中的定位, 荧光不具有区域的特异性, 充满了整个细胞, 表明该基因产物并非作用于专一的细胞器.
结论: H. pylori ggt同源基因适合于杆状病毒表达, 表达产物具有GGT活性, 但他对细胞的作用有待进一步研究.
Keywords: 幽门螺杆菌; 谷氨酰转肽酶; 表达; 杆状病毒