基础研究
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世界华人消化杂志. 2006-01-08; 14(1): 39-44
Published online 2006-01-08. doi: 10.11569/wcjd.v14.i1.39
鼠反义转化生长因子βⅠ型受体真核表达质粒的构建与鉴定
徐丽红, 郑勇, 周婷, 李睿, 陈莹
徐丽红, 郑勇, 李睿, 陈莹, 新疆石河子大学第一附属医院消化内科 新疆维吾尔族自治区石河子市 832008
周婷, 新疆石河子大学第一附属医院中心实验室 新疆省石河子市 832008
徐丽红, 女, 1970-08生, 汉族, 新疆石河子大学石河子医学院内科学在读硕士, 主治医师, 主要从事肝纤维化方面的研究.
基金项目: 兵团博士资金资助项目, No. 05JC08.
通讯作者: 郑勇, 832002, 新疆维吾尔族自治区石河子市, 新疆石河子大学第一附属医院消化内科. shzds-sh@xj.cninfo.net
收稿日期: 2005-10-25
修回日期: 2005-11-03
接受日期: 2005-11-26
在线出版日期: 2006-01-08
Abstract

目的: 构建鼠反义转化生长因子βⅠ型受体(TβRⅠ)基因pcDNA3.1(+)真核表达质粒, 为进一步研究通过TβRⅠ干预肝纤维化的发生发展提供实验基础.

方法: 将取冰冻保存的大鼠肝组织, 应用TRIzol法提取总RNA, 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性, 并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度. 使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因TβRⅠ cDNA片段, 采用巢式PCR扩增TβRⅠ基因片断. 用CaCl2法诱导感受态细胞. 将真核表达载体pcDNA3.1(+)在多克隆位点处用EcoRⅠ、XholⅠ双酶切线性化, 切胶纯化回收; TβRⅠ基因片断双酶切后切胶纯化回收; 将纯化回收的pcDNA3.1(+)线性化载体和TβRⅠ基因片段定向及反向连接, 构建以pcDNA3.1(+)为载体的反义TβRⅠ基因真核表达质粒. 转化JM109大肠杆菌. 酶切证实的阳性克隆行测序分析.

结果: 琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性, 见28S, 18S条带完整, 而且28S条带亮度为18S的1倍左右, 认为RNA完整性良好; 并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280 = 1.915 0, 认为RNA纯度良好; RNA浓度为770 mg/L. 阳性克隆质粒经双酶切后行10 g/L琼脂糖凝胶电泳在DNA Marker 430 bp和线性化纯化后pcDNA3.1(+), 5.3 kb附近可见两条明显条带, 与所需目的片段大小相符, 证实为阳性克隆, 重组质粒构建成功. DNA测序结果与预期目的片段序列一致.

结论: 鼠反义TβRⅠ/pcDNA3.1(+)真核表达重组质粒构建成功.

Keywords: 反义; 质粒; 转化生长因子βⅠ型受体; 肝纤维化