基础研究
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世界华人消化杂志. 2005-08-15; 13(15): 1814-1818
Published online 2005-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i15.1814
人脐血间充质干细胞体外诱导分化为类肝细胞
何念海, 赵文利, 王宇明
何念海, 赵文利, 王宇明, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所 重庆市 400038
何念海, 男, 1965-03-20生, 四川省遂宁市人, 汉族. 第三军医大学医学博士, 副教授, 副主任医师, 主要从事生物人工肝及相关基础研究.
基金项目: 国家高技术研究发展计划(863)资助项目, No. 2001AA216161.
通讯作者: 王宇明, 400038, 重庆市沙坪坝区高滩岩正街30号, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所. wym417@mail.tmmu.com.cn
收稿日期: 2005-04-26
修回日期: 2005-05-22
接受日期: 2005-06-01
在线出版日期: 2005-08-15
Abstract

目的: 建立人脐血间充质干细胞(umbilical cord blood mesenchymal stem cells, UCBMSC)的体外分离、培养方法, 体外诱导UCBMSC分化为类肝细胞, 观察UCBMSC细胞生物学特性, 并对类肝细胞进行分子生物学及功能鉴定.

方法: 采用体外细胞培养技术, 分离培养人脐血UCBMSC, 在10 g/L Matrigel作基质, 2.5 mmol/L AZA预处理10-12 h, HGF 10 mg/L+FGF4 10 mg/L+HGM培养基中诱导. 用显微摄像和MTT研究细胞增殖及生长特征, 用流式细胞仪、免疫组织化学、RT-PCR鉴定细胞表型. 采用ELISA法检测培养上清中人白蛋白水平.

结果: 每份脐血可获得150±20个贴壁细胞; 细胞种植后6 d达到对数生长期.连续传10代后, 每份脐带血UCBMSC可扩增达109-1010个细胞. UCBMSC表型为CD44及CD166阳性, CD34及CD45阴性. 在添加FGF4和HGF的Matrigel上诱导培养的UCBMSC在21-28 d时, 形态由长梭形变为三角形, 多角形或类圆形. 细胞转圆率为40%-50%, 双核细胞比率5%-7%. 免疫组化, RT-PCR检测显示未诱导培养的UCBMSC中, 有较少的细胞表达AFP及其mRNA, 未见其他肝脏特有的转录因子或者胞质蛋白标志. 诱导早期可见较多细胞表达GATA4, AFP和CK19及其mRNA, 至诱导后期表达下降, 而ALB, CK18, GST-p和肝细胞转录因子HNF1a表达逐渐上升. ALB, CK18阳性细胞比例达61%-65%.未诱导分化的UCBMSC没有分泌ALB和产生尿素, 诱导分化的UCBMSC以时间依赖方式产生白蛋白.

结论: 人脐血UCBMSC先分化为肝前体细胞, 再分化为成熟肝细胞, 获得了在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞, 已具备肝细胞特有的分泌白蛋白功能.

Keywords: 人脐血间充质干细胞; 类肝细胞; 分化; 白蛋白