研究快报
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世界华人消化杂志. 2005-07-15; 13(13): 1609-1611
Published online 2005-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i13.1609
应用抑制性消减杂交技术克隆乙型肝炎病毒前-X蛋白反式激活基因
杨倩, 张黎颖, 成军, 洪源, 刘妍, 王琳, 董菁, 张树林
杨倩, 张黎颖, 成军, 洪源, 刘妍, 王琳, 董菁, 北京地坛医院传染病研究所 北京市 100011
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队九、五科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队十、五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队十、五科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市东城区安外大街地坛公园13号, 北京地坛医院传染病研究所 cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真: 010-64281540
收稿日期: 2005-01-17
修回日期: 2005-05-20
接受日期: 2005-05-25
在线出版日期: 2005-07-15
Abstract

目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建乙型肝炎病毒(HBV)前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库, 克隆前-X反式激活相关基因, 了解该段基因的可能生物学功能.

方法: 构建表达质粒pcDNA3.1(-)-前-X, 转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照; 提取转染后细胞的mRNA, 反转录为cDNA.cDNA经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR), 将产物与pGEM-Teasy载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到45个白色克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-1 000 bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序, 并通过生物信息学分析获得13种已知功能基因序列.

结论: 应用SSH技术成功构建了前-X基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.该文库的建立为阐明该基因生物学功能提供理论依据.

Keywords: N/A