研究快报
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世界华人消化杂志. 2005-01-01; 13(1): 82-85
Published online 2005-01-01. doi: 10.11569/wcjd.v13.i1.82
应用抑制性消减杂交技术克隆NS5A-TP2(615)反式激活基因
杨倩, 成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 董菁, 张树林
杨倩, 成军, 刘妍, 洪源, 王琳, 董菁, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-02-14
修回日期: 2004-09-17
接受日期: 2004-10-18
在线出版日期: 2005-01-01
Abstract

目的: 应用抑制性消减杂交技术构建人类新基因NS5ATP2(615)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库, 克隆NS5ATP2反式激活相关基因, 了解该基因的可能生物学功能.

方法: 构建NS5ATP2表达质粒pcDNA3.1(-)NS5ATP2-TP2转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)转染的HepG2细胞为对照; 提取转染后细胞的mRNA, 反转录为cDNA. 半定量RT-PCR显示实验组NS5ATP2的转录水平明显高于对照组. cDNA经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制多聚酶链反应(PCR), 将产物与pEGM-Teasy载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建人类新基因NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库. 文库扩增后得到76个白色克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-1000 bp插入片段. 挑取含有插入片段的32个克隆进行测序, 并通过生物信息学分析获得17种已知功能基因序列, 和2个未知功能基因.

结论: 应用SSH技术成功构建了NS5ATP2反式激活基因差异表达的cDNA消减文库. 该文库的建立为阐明NS5ATP2生物学功能提供理论依据.

Keywords: N/A