人胎儿骨髓间充质干细胞来源的类肝细胞的分子生物学鉴定

Abstract

目的: 对MMSCs来源类肝细胞进行分子生物学鉴定.

方法: 从人胎儿骨髓中分离MMSCs, 在10 g/L Matrigel作基质, 2.5 mmoL/L AZA预处理10-12 h, HGF 10 μg/L＋FGF4 10 μg /L+ HGM培养基中培养和诱导. 收集诱导培养4, 7, 14, 21, 28 d时的细胞爬片, SABC免疫组化法DAB显色检测肝细胞早期标志AFP, CK19及早期转录因子GATA4, 成熟肝细胞标志ALB, CK18, GST-π, 肝细胞转录因子HNF1α; 提取诱导分化10 d和第28 d细胞RNA及蛋白质, 设计AFP, CK19, ALB, CK18, CYP1B1, CYP2B6引物, 进行RT-PCR, 观察在mRNA水平肝细胞标志的表达, 采用Western blot检测CK18, AFP, ALB的表达量.

结果: 未诱导培养的MMSCs中, 有较少的细胞表达AFP, 未见其他肝脏特有的转录因子或者胞质蛋白标志. 免疫组化显示在诱导早期可见较多细胞呈GATA4, AFP和CK19阳性表达, 至诱导后期表达下降, 而ALB, CK18, GST-π和肝细胞转录因子HNF1α阳性细胞比例逐渐上升. RT-PCR显示, 未诱导的MMSCs仅可表达微弱的AFP mRNA, 诱导早期可见AFP mRNA和CK19 mRNA表达, 诱导后期未见扩增, 而ALB, CK18, CYP1B1 mRNA早期和后期均可见表达, 在诱导后期可见CYP2B6 mRNA表达, 但很弱. Western blot检测显示诱导细胞中AFP, ALB和CK18蛋白的表达趋势同基因表达类似. 在65 ku和68 ku处诱导细胞组可见AFP和ALB目的条带, 在45 ku处诱导细胞组可见CK18目的条带. 未诱导的细胞和诱导早期细胞中AFP有表达, 后期未见. 诱导早期和后期CK18和ALB均有表达, 且后期增强.

结论: MMSCs向类肝细胞的横向分化是先分化为肝前体细胞, 再分化为成熟肝细胞, 在本实验诱导条件下可获得在复制及翻译各环节肝细胞标志阳性的类肝细胞.

Keywords: N/A