病毒性肝炎
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世界华人消化杂志. 2004-07-15; 12(7): 1564-1568
Published online 2004-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i7.1564
应用抑制性消减杂交技术筛选HBV DNA聚合酶中RNase H的反式调节基因
王春花, 郎振为, 成军, 吴煜, 杨艳杰, 张黎颖, 党晓燕
王春花, 郎振为, 首都医科大学北京佑安医院病理科 北京市 100054
成军, 吴煜, 杨艳杰, 张黎颖, 党晓燕, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
王春花, 女, 1974-05-14生, 山东省荣成市人, 汉族. 2001年首都医科大学博士生, 主要从事肝脏疾病的基础研究及临床工作.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队九五科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队十五科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队十五科技攻关项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-02-14
修回日期: 2004-03-01
接受日期: 2004-05-11
在线出版日期: 2004-07-15
Abstract

目的: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建HBV DNA聚合酶(DNA P)末端蛋白反式激活基因.

方法: 以RNase H表达质粒pcDNA3.1(-)-RNase H转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为对照; 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR, 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 文库扩增后得到38个白色克隆, 经菌落PCR分析, 得到36个200-1 000 bp插入片段. 对所得片段测序, 并进行同源性分析, 显示33种已知基因编码蛋白和3种未知功能基因序列, 可能是RNase H反式激活靶基因.

结论: 成功构建HBV RNase H反式激活基因差异表达的cDNA消减文库.

Keywords: N/A