病毒性肝炎
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世界华人消化杂志. 2004-11-15; 12(11): 2576-2580
Published online 2004-11-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i11.2576
应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒核心抗原反式调节基因
徐志强, 张鸿飞, 成军, 王建军, 刘妍, 纪冬
徐志强, 张鸿飞, 成军, 王建军, 刘妍, 纪冬, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
徐志强, 男, 主治医师, 中国人民解放军第302医院感染三科, 主要从事传染病临床与病毒性肝炎的发病机制研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135
通讯作者: 成军, 100039, 北京市, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心, 全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2004-03-15
修回日期: 2004-09-13
接受日期: 2004-10-18
在线出版日期: 2004-11-15
Abstract

目的: 筛选与克隆HBcAg反式调节基因, 了解其在体内的调节功能线索及机制.

方法: 以分子生物学技术构建HBcAg的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HBcAg, 以表达质粒pcDNA3.1(-)-HBcAg转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR), 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建人HBcAg激活基因差异表达的cDNA消减文库. 文库扩增后得到33个阳性克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-800 bp插入片段. 对插入片段测序, 并通过生物信息学分析获得其全长基因序列, 结果共获得17种编码基因.

结论: 筛选到的cDNA全长序列, 包括一些与细胞生长调节、物质代谢及肿瘤发生密切相关的蛋白编码基因, 推测了HBcAg在体内可能存在的调控机制的线索, 尚需进一步的实验证明.

Keywords: N/A