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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因C-12的研究
陆荫英, 陈天艳, 成军, 邵清, 梁耀东, 王琳, 刘妍, 张健, 李克, 张玲霞, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
陆荫英, 女, 1973-08-27生, 贵州省贵阳市人, 汉族. 博士, 2003年军医进修学院毕业, 主治医师. 主要从事肝病的基础及临床工作.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目 , No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No.98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
Abstract
目的
乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中, 对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的, HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和CD4+T细胞免疫反应的重要抗原, 寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因, 是研究HBcAg生物学功能的重要途径.
方法
用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因, 连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落, PCR从中扩增出目的片段并测序, 进行生物信息学分析. 根据GenBank的信息设计新基因的引物, 从HepG2 细胞的mRNA中逆转录PCR扩增出C-12#新基因的完整序列, 连入另一酵母表达载体pGADT7, 并转化进酵母细胞Y187, 再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交), 以进一步证实HBcAg与C-12新基因编码蛋白的结合作用.
结果
成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中表达, 配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长, 并变成蓝色的真阳性菌落16个, 其中未知基因4个. 用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出C-12#新基因的完整序列, 回交实验再次证实二者之间的结合作用.
结论
成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白, 发现未知功能基因, 为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
Keywords: N/A