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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白E-19的研究
陆荫英, 邵清, 成军, 陈天艳, 王琳, 梁耀东, 刘妍, 张健, 李克, 张玲霞, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
陆荫英, 女, 1973-08-27生, 贵州省贵阳市人, 汉族. 博士, 2003年军医进修学院毕业, 主治医师. 主要从事肝病的基础及临床工作.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目 , No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No.98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
Abstract
目的
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对HBV的感染和复制都不是必须的, 普遍认为其与HBV引起免疫耐受、免疫系统功能障碍有关. 筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg相互作用蛋白的基因, 明确其具体作用机制.
方法
应用酵母双杂交系统3, 将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HBeAg基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落, 提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上选择并测序, 结果在GenBank中进行生物信息学分析. 并根据GenBank中的序列信息设计引物从并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中, 体外免疫共沉淀方法再次验证二者之间的结合作用.
结果
成功克隆出HBeAg基因并在酵母细胞中表达, 与肝文库配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能使X-α-gal变成蓝色的真阳性菌落39个, 其中有5个未知基因, 在GenBank中未找到同源序列, 在HepG2细胞的mRNA中成功扩增出该基因的全序, 体外免疫共沉淀方法证明HBeAg与新基因E-19表达的蛋白质在体外也有结合作用.
结论
成功克隆出HBeAg的肝细胞结合蛋白, 发现与HBeAg有相互作用的未知蛋白新基因, 为HBeAg的功能研究提出新线索.
Keywords: N/A