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胃肠道平滑肌细胞作为eNOS基因转移靶细胞的研究
宁守斌, 张忠兵, 谢渭芬, 杨秀疆, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院消化内科上海市 200003
宁守斌, 男, 1973-11-06生, 甘肃省景泰县人, 汉族, 上海第二军医大学博士研究生, 主要从事胃肠激素与胃肠动力的研究.
沈茜, 中国人民解放军第二军医大学附属长海医院实验诊断科上海市 200433
赵新, 中国人民解放军第二军医大学附属长海医院血管外科上海市 200433
信栓力, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院心内科上海市 200003
通讯作者: 张忠兵, 200003, 上海市凤阳路415号, 中国人民解放军第二军医大学附属长征医院消化内科. zhongbingz@yahoo.com.cn
电话: 021-63610109-73254
收稿日期: 2002-10-09
修回日期: 2002-10-20
接受日期: 2002-10-30
在线出版日期: 2003-07-15
修回日期: 2002-10-20
接受日期: 2002-10-30
在线出版日期: 2003-07-15
Abstract
目的
构建内皮型一氧化氮合酶(eNOS)腺病毒表达载体, 介导eNOS在胃肠道平滑肌细胞中稳定表达并评价表达产物eNOS的酶学活性.
方法
构建牛eNOS的重组腺病毒表达载体Ad-eNOS, 感染体外培养的猫下段食管及胃底部平滑肌细胞, 采用Western blot 、 RT-PCR技术检测eNOS在平滑肌细胞中的表达, 测定基因转移后NOS活性以及一氧化氮(NO)产量, 并研究不同施加因素对NOS活性及NO合成的影响.
结果
Ad-eNOS可高效感染体外培养的胃肠平滑肌细胞(MOI = 50, 感染效率 = 74%), Western blot 、 RT-PCR结果证实eNOS在平滑肌细胞中高效表达. Ad-eNOS感染细胞后基础NOS活性比感染前显著增高(93±13 vs 47±13 nkat/L, P<0.05), 培养液中累积的NO增加了3倍(45±13 vs 16±7 μmol/L, P<0.05). 分别加入L-精氨酸(10-4 mol/L)、钙离子(10-4 mol/L)、EGTA(钙离子螯合剂, 10-4 mol/L)及L-NAME(NOS抑制剂, 10-3mol/L)后, NOS活性分别为94±8, 173±25, 29±6, 58±11 nkat/L, NO含量分别为48±14, 106±18, 6±2, 17±11 μmol/L.
结论
构建的重组腺病毒Ad-eNOS能够高效介导eNOS基因在消化道平滑肌细胞中表达, 表达产物eNOS活性受钙离子浓度调节, 其作用底物L-精氨酸并不是NO合成的限速步骤.
Keywords: N/A