Copyright
©The Author(s) 2003. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因
牟劲松, 刘妍, 王刚, 成军, 段惠娟, 李克, 陆荫英, 王琳, 王惠芬, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心北京市100039
牟劲松, 男, 1971-02-20生, 汉族, 1995年解放军第三军医大学毕业, 医学硕士, 主治医师, 从事病毒性肝炎的临床治疗及实验研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 , No. 39970674 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2002-10-29
修回日期: 2002-11-15
接受日期: 2002-11-28
在线出版日期: 2003-04-15
修回日期: 2002-11-15
接受日期: 2002-11-28
在线出版日期: 2003-04-15
Abstract
目的
应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库, 克隆HCVNS3反式激活相关基因.
方法
以HCVNS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为对照; 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR, 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.
结果
文库扩增后得到70个白色克隆, 经菌落PCR分析, 得到56个200-1000bp插入片段.对所得片段测序, 并进行同源性分析, 获得6个差异表达的未知序列, 可能是NS3反式激活的新的靶基因.
结论
成功构建HCVNS3反式激活的相关基因cDNA消减文库, 为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础.
Keywords: N/A