幽门螺杆菌培养及抗原蛋白的分离纯化

表1 幽门螺杆菌培养基的选择

菌种	基础培养基	抗生素	添加物	培养结果	参考文献
ATTC43504	脑心浸液(BHI)	萘啶酸(10 g/L, 万古霉素(6 g/L), 两性霉素B(2 g/L), 多黏菌素B(16 g/L)	50 g/L改良的巧克力琼脂(新鲜羊血∶热羊血 = 2∶1), 10 g/L Isovitalex	分离率: 92.6%	Ding et al[14], 2001
12476(恒河猴)	布氏肉汤琼脂(固)	万古霉素(3 mg/L), 甲氧卞二氨嘧啶(5 mg/L), 两性霉素B(2 mg/L)	脱纤维蛋白马血(50 mL/L), IsoVitaleX(10 mL/L), 氯血红细胞素(1 g/L)	7×1013 CFU/L	Kitsos et al[15], 1998
12476(恒河猴)	布氏肉汤琼脂(液)	万古霉素(3 mg/L), 甲氧卞二氨嘧啶(5 mg/L), 两性霉素B(2 mg/L)	脱纤维蛋白马血(50 mL/L), IsoVitaleX(10 mL/L),氯血红细胞素(1 g/L)	6.8×1013 CFU/L	Kitsos et al[15], 1998
CCUG17874	布氏肉汤(液)	头孢磺啶(6 mg/L), 万古霉素 (5 mg/L), 甲氧苄氨嘧啶(10 mg/L), 两性霉素B(8 mg/L)	(2, 6-di-O-methyl)-βCD(2 g/L)	1.85 A580nm	Marchini et al[16],1995
ATCC49503	脑心浸液琼脂(BHI)	100 mL含TMP 50 mg, 古霉素60 mg, 多黏霉素B 2500 IU,两性霉素20 mg	2, 6-di-O-methyl-β-cyclodextrin	无	Ohno et al[17], 2007
NCTC11637	哥伦比亚琼脂(CAB)	40 mL中含万古霉素(16 mg), 两性霉素B(16 mg), 多黏菌素B(0.6 mg), 三甲氧卞二胺嘧啶(8 mg)	脱纤维绵羊血	4.0×1011 CFU/L	谢献胜 et al[18], 2006

表2 H pylori抗原蛋白的重组表达

抗原蛋白	基因提取	重组载体	转化细菌	诱导表达	结果	参考文献
Urease	酚/氯仿抽提	pHP802	E.coli HB101, DH5a	IPTG诱导表达, LA液体培养基	Western blot证实获得UreB重组蛋白扩增出的ure基因和基因库中的相同, Western blot检测到特异性蛋白条带	Hu et al[45], 1992
Urease	CTAB法抽提	pIRES	减毒沙门氏菌LB5000	IPTG诱导表达, LB培养液		徐灿 et al[46]2005
Urease	基因组抽提试剂盒	pET28	E.coli BL21	IPTG诱导表达, LB培养液	PCR扩增出414 bp的目的片段, 免疫印迹表明、重组蛋白能够被特异性血清识别	袁小澎 et al[47]2007
VacA	酚/氯仿抽提	pMM592	E.coli ER2566	IPTG诱导表达, TBKAN培养液	免疫印迹分析, 能与H pylori(+)患者血清发生结合, ELASA检验重组蛋白有良好的抗原性	McClain et al[48], 2003
VacA	酚/氯仿抽提	pQE31	E.coli M15	IPTG诱导表达, LA培养液	SDS-PAGE显示表达产物Mr为37 000和58 000	杨贵珍 et al[49], 2006
VacA	碱裂解法	pET32a	E.coli BL21	IPTG诱导表达, LB培养液	ELASA检验重组蛋白有良好的抗原性	段秀杰 et al[50], 2006
CagA	基因组提取	pMD18-T, 试剂盒	E.coli TOP10 pGEX-4T-1	IPTG诱导表达, LB培养液	SDS-PAGE显示表达产物Mr为37 000和60 000, 免疫印迹分析, 能与H. pylori(+)患者血清发生结合	宁云山 et al[51],2006
CagA	基因组提取 试剂盒	pMG36e	L. lactis	IPTG诱导表达	DNA序列分析表明重组基因与原基因有97.4%的一致性, Western bolt 2006证实了重组蛋白的存在及强的免疫原性	Kim et al[52], 2006
CagA	基因组提取 试剂盒	pET42a	E.coli BL21	IPTG诱导表达, LB培养液	该抗原检测抗体的敏感性为92.9%	张静 et al[53], 2005

表3 H. pylori抗原蛋白的纯化

抗原蛋白	初步分离	纯化	结果	参考文献
Urease	离心→重悬→超速离心	凝胶过滤层析(Superose 12 HR 10/30柱, 缓冲液20 mmol/L磷酸盐和0.15 mmol/L NaCl, pH7.4)→过夜透析→阴离子交换层析(DEAE-5PW SpHerogel TSK-IEX柱, pH7.0, 20 mmol/L磷酸盐缓冲液)→ 500 mmol/L NaCl线性梯度洗脱	尿素酶回收率为80%, 当把细菌暴露在200-1000 mL/L的乙醇中时, 总酶活力达70%, 尿素能被浓缩112倍, 总回收率达13%	Dunn et al[54],1990
Urease	离心	DEAE-SepHarose层析→pHenyl-SepHarose层析→Mono Q层析→Superose 6层析	尿素酶能浓缩1070倍, 产量达25%	Todd et al[55], 1987
Urease	重悬→细菌破碎→离心除膜	DEAE-琼脂糖凝胶层析(1.5-7.5 cm)→ 23℃, 分阶段性用PHenyl-琼脂糖凝胶 (1.5-12 cm), Mono-Q(HR5/5), Superose 6(1.0-29.5 cm)	尿素酶浓缩17倍, SDS-PAGE检验只有一条条带	Hu et al[56],1990
Urease	离心→重悬→ 细菌破碎→ 离心除膜	DEAE-SepHarose柱层析→pHenyl-SepHarose柱层析→Mono-Q柱层析→ Superose 6柱层析	尿素酶吸光度2.0A	Hu et al[56],1990
Urease	离心→重悬→ 细菌破碎→超滤	离子交换层析(Source Q15离子交换柱), NaCl梯度洗脱	H. pylori阳性检出率100％(12/12), 阴性符合率100％(18/18). 特异性良好	白慕群 et al[57], 2000
VacA	离心→盐析→离心→重悬	疏水作用层析(pHenyl-Superose HR 5/5柱)→凝胶过滤层析(Superose 12 HR 16/50柱)→阴离子交换层析(Mono-Q HR 515柱, NaCl梯度洗脱)	3/4过三步层析后, 空泡毒素效价在24 000±5600, 浓缩倍数能够达到5333倍	Cover et al[58], 1992
VacA	离心→盐析→ 离心→重悬→微滤	凝胶过滤层析(Superose 12 HR 16/50或Superose 6 HR 16/50柱, 60 mmol/L Tris, 100 mmol/L NaCl, pH7.5)		Cover et al[58], 1992
VacA	离心→盐析→密度梯度离心	自动Densi-Flow IIC装置		Cover et al[59],1997
VacA	溶菌酶处理→超声波→离心	NiTEMTM树脂柱平衡后, 用混合液(50 mmol/L Tris, pH8.0, 300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Imidazole)洗脱 →离心		段秀杰 et al[50], 2006
VacA	盐析→离心→ 透析→离心	吸附层析→盐析→重悬→透析→疏水作用 层析(PHeny1-SepHarosc CL-4B柱)→阴离子交换层析(DEAE-E ScpHamsc FF柱, NaCl连续梯度洗脱→凝胶过滤层析→透析→离心→快速蛋白液相层析系统(FPLC)AKTA explorer-900	VacA蛋白浓度为0.125 mg/mL, 比活力达20 480, 与上清Ô液相比纯化倍数达4551, 产率为5 ug/L	杜奕奇 et al[60], 2002
CagA	离心	SepHadexG25凝胶过滤层析→阴离子 交换介质(High Q), 梯度洗脱	3/4生物电泳图象分析系统的密度扫描鉴定, 所得产物的纯度为90％	龚岷 et al[61], 2001
CagA	离心	金属螯合层析	3/4密度扫描鉴定, 这种方法所得产物的纯度为94.5%	龚岷 et al[61], 2001
CagA	用6 mol/L胍透析菌液	凝胶过滤层析		Ye et al[62], 2003
LPS	酶处理	辛基琼脂糖层析(用0.1 mmol/L醋酸钠, 0.5 mmol/L NaCl, pH4.7的缓冲液洗脱. 30%-60%的线性梯度洗脱) →PD-10脱盐柱, 2 g/L三乙胺平衡柱子		Yokota et al[63], 2007
LPS	苯酚-氯仿-石油醚处理→离心	上清液中脂多糖沉淀→离心		Slomiany et al[64], 2003
LPS	超声波→离心	抽提离心→透析→DNA和RNA酶作用→ 水浴→离心→上清加无水乙醇→离心→ 沉淀用蒸馏水悬浮→透析		严杰 et al[65], 1994