线粒体基因在大肠癌组织中缺失突变的检测

摘要

目的: 探讨4 977 bp大片段线粒体DNA(mtDNA)缺失与肿瘤的关系.

方法: 收集2008年中国人民解放军北京军区总医院及济南军区第456医院50例外科手术患者的大肠癌(colorectal cancer, CRC)组织和癌旁正常组织标本. 采用长距离PCR方法检测50例CRC组织、相应的癌旁正常组织和20例非癌患者正常肠组织中4 977 bp mtDNA的缺失情况.

结果: CRC组织标本中检测到4 977 bp mtDNA的缺失率为10%(5/50), 相应的癌旁组织缺失率为18%(9/50), 其中3例CRC组织和癌旁正常组织中4 977 bp mtDNA均有缺失, 6例在CRC组织中未发现却在癌旁正常组织中检测到4 977 bp mtDNA缺失. 20例非癌患者正常肠黏膜组织中4 977 bp mtDNA片段缺失率为15%(3/20). 4 977 bp mtDNA缺失率具有随年龄增大而升高的趋势, 将组织样本分为高年龄组(≥60)和低年龄组(<60). 高年龄组4 977 bp mtDNA缺失率显著高于低年龄组(P<0.01).

结论: CRC癌变过程中, 线粒体缺失不是导致CRC的主要原因.

关键词: 线粒体DNA; 大肠癌; 缺失; 突变

Detection of the 4 977 bp deletion mutation of mitochondrial DNA in colorectal cancer

Hai-Hong Cui, Bin Wang, Ying Han, Ai-Min Li, Wei Wei, Bao-Yan Zhang

Hai-Hong Cui, Bin Wang, Ai-Min Li, Wei Wei, Department of Internal Medicine, the 456th Hospital of Chinese PLA, Jinan 250031, Shandong Province, China

Ying Han, Department of Gastroenterology, General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China

Bao-Yan Zhang, Department of Pathology, the 117th Hospital of Chinese PLA, Hangzhou 310013, Jiangsu Province, China

Correspondence to: Ying Han, Department of Gastroenterology, General Hospital of Beijing Military Command, Beijing 100700, China. yingh721003@sina.com

Received: April 29, 2010
Revised: August 3, 2010
Accepted: August 10, 2010
Published online: September 28, 2010

Abstract

AIM: To investigate the relationship between the 4 977-bp deletion mutation of mitochondrial DNA (mtDNA4977 deletion mutation) and the development of colorectal cancer.

METHODS: Colorectal cancer and cancer-adjacent neoplastic tissue samples taken from 50 colorectal cancer patients treated at the General Hospital of Beijing Military Command and the 117th Hospital of Chinese PLA in 2008, and normal colorectal tissue samples collected from 20 patients without colorectal cancer were included in this study. The mtDNA4977 deletion mutation in these samples was detected by long PCR.

RESULTS: The mtDNA4977 deletion mutation was detected in 10% (5/50) of colorectal cancer samples, 18% (9/50) of cancer-adjacent neoplastic tissue samples, and 15% (3/20) of normal colorectal tissue samples. The detection rate of the mtDNA4977 deletion mutation increased with age in all the three types of samples. The detection rate of the mtDNA4977 deletion mutation in high-age (≥60 years) group was significantly higher than that in low-age (<60 years) group (P < 0.01).

CONCLUSION: The mtDNA4977 deletion mutation is not specific to colorectal cancer and may not play an important role in the carcinogenesis of colorectal cancer.

Key Words: Mitochondrial DNA; Colorectal cancer; Deletion; Mutation

0 引言

线粒体是真核细胞的重要胞质细胞器, 他含有自己的基因组, 且能够复制、转录和翻译. 随着对线粒体在细胞凋亡和诱发细胞癌变等肿瘤生物学过程中作用地进一步研究, mtDNA突变成为肿瘤研究的热点之一. 报道的mtDNA序列改变包括发生于编码区及非编码区内的各种点突变、片段缺失、重复或插入突变及微卫星不稳定性等[1]. 线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)4 977 bp大片段缺失是最常见的一种片段缺失突变, 已在胃癌、喉癌、食管癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中相继被报道. 为探讨mtDNA 4 977 bp大片段缺失与大肠癌的关系, 我们检测了mtDNA 4 977 bp大片段缺失在大肠癌组织、癌旁正常组织及非癌患者肠组织的分布频率.

1 材料和方法

1.1 材料

50例大肠癌组织和癌旁肠组织标本均取自2008年中国人民解放军北京军区总医院及济南军区第456医院外科手术患者, 均经病理确诊. 癌旁肠组织标本为同一患者病灶远端5 cm以上的正常大肠组织, 每例癌标本均用40 g/L甲醛溶液固定, 石蜡包埋, 5 μm连续切片15-20张, 取中间部分切片HE染色后进行组织学诊断. 病灶远端非癌组织也进行组织学诊断, 证实其没有癌细胞. 其中男31例, 女19例, 年龄27-84(平均年龄54)岁. 根据大肠癌PTNM分期标准进行诊断, 其中直肠27例, 左半结肠12例, 右半结肠11例. 所有大肠癌标本均经病理诊断证实, 其中高分化22例, 中分化23例, 低分化5例, 临床分期Ⅰ期5例, Ⅱ期13例, Ⅲ期18例, Ⅳ期14例. 全部患者术前均未接受放射治疗和化学治疗.

1.2 方法

1.2.1 组织基因组总DNA提取: 采用酚、氯仿、异丙醇抽提法提取基因组总DNA. 所得DNA溶于TE溶液, 紫外分光光度计进行定量, -20 ℃保存备用.

1.2.2 mtDNA长距离PCR扩增: 为验证所提取的总DNA质量能否满足长距离PCR扩增的需要, 我们在很少发生缺失突变的mtDNA保守区域设计了1对引物(P1/P2), 序列如下: P1, 5'-AACATACCCATGGCCAACCTCCTAC-3'(3 304-3 328 nt); P2, 5'-AGTTAGCTTTACAGTGGGCTCTAGA-3'(8 310-8 286 nt), 待扩增mtDNA片段长度为5 006 bp. 因为线粒体存在异质性, 我们只能在可能发生缺失的两侧设计引物. 检测mtDNA 4 977 bp缺失突变的存在情况所用引物对(P3/P4), 引物序列如下: P3, 5'-TACTCCTTACACTATTCCTCATCAC-3'(8 412-8 436 nt); P4, 5'-GGGGAAGCGAGGTTGACCTGTTAGG-3'(3 650-3 626 nt). 预期扩增mtDNA片段长度为5 238 bp, 若存在mtDNA 4 977 bp缺失突变, 将扩增出长为261 bp的DNA片段.

PCR扩增采用TaKaRa PCR kit Ver 2.1扩增试剂盒. PCR反应体系为10 μL, 终浓度为: TaKaRa Taq酶 0.1 U, MgCl2 0.5 μL, dNTP 0.5 μL, 引物各1 μL, 模板DNA约200 ng. 反应条件: 94 ℃预变性3 min, 其余30个循环94 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s、68 ℃ 7 min, 最后72 ℃延伸10 min. PCR产物5 μL于加有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶中电泳, 电泳缓冲液为1×TBE, 电压60 V. 凝胶在凝胶成像仪上观察, 摄片.

统计学处理 实验数据分析使用SPSS16.0统计学分析软件进行处理, 采用卡方Fisher精确概率检验, P<0.05时有显著性差异.

2 结果

2.1 大肠癌组织、癌旁正常组织及正常肠组织mtDNA 4 977 bp缺失率的检测

组织样本中提取的总DNA应用引物对P1/P2均可扩增出mtDNA保守片段的5 006 bp产物(图1), 说明所提取的mtDNA模板质量良好, 长距离PCR扩增方法可靠. 所有标本使用引物对P3/P4可扩增出5 238 bp产物(图2), 缩短延长时间(10 min-45 s), 用普通Taq酶扩增P3/P4引物, 部分DNA可扩增出261 bp产物(图3), 其经克隆测序证实为261 bp目的片段(图4). 这说明大肠癌组织中存在4 977 bp mtDNA缺失的现象. 大肠癌组织、癌旁正常组织及正常肠组织mtDNA 4 977 bp缺失率和年龄的相关性见表1.

表1 大肠癌组织、癌旁正常组织及正常肠组织mtDNA 4 977 bp缺失率和年龄的相关性 (%).

年龄	结肠癌			癌旁组织			正常对照			P值
	+	-	+	+	-	+	+	-	+
<60	0	25	0	1	24	4	1	11	8.3	0.390
≥60	5	20	20	8	17	32	2	6	25.0	0.624
合计	5	45	10	9	41	18	3	17	15.0	0.514
P值	0.05			0.023			0.54

图1 P1/P2对线粒体保守片段的检测.

图2 P3/P4对mtDNA 4 977 bp缺失的检测.

图3 mtDNA 4 977 bp缺失的检测.

图4 mtDNA 4 977 bp缺失片段的测序结果.

3 讨论

mtDNA 4 977 bp缺失是最为常见的一种缺失突变. 他位于mtDNA序列8 472-13 447, 4 977 bp缺失区的两端为13个碱基的重复序列, 即8 472-8 484和13 447-13 459. 错配的关键位点在缺失两侧的直接重复序列. 缺失影响构成线粒体呼吸链7个多肽(ATP酶亚单位6和8、细胞色素氧化酶Ⅲ和NADH亚单位ND3、ND4、ND4L和ND5)的编码基因和线粒体蛋白质合成必须tRNA 22个中的5个, 进而影响呼吸链的完整性, 导致生物功能缺陷. 这种缺失已经引起人们的广泛兴趣, 因为他已被认为是引起骨髓-胰腺综合征(bone marrow-pancreatic syndrome, pearson)、Keams-Sayre综合征(KSS)、慢性进行性眼外肌麻痹(chronic progressive external ophthalmoplegia, CEPO)的原因[2]. 此外, 还认为这种缺失在老化过程中会引起神经肌肉功能失调, 他是一个机体老年化的分子生物学标志. 滑行错配、氧化物损伤和有限的自我修复能力可能是导致mtDNA 4 977 bp缺失发生的原因. 生长缓慢的组织mtDNA缺失发生率通常远高于那些分裂增生活跃的组织. 研究认为越是分裂增生活跃的组织能承受缺失mtDNA占总mtDNA数比例的阈值越低[3]. mtDNA是致癌物作用的重要靶点, mtDNA突变目前已在胃癌、肺癌、食管癌和白血病等多种肿瘤及肿瘤细胞株中发现[4]. 有关mtDNA 4 977 bp缺失突变在细胞癌变中的作用及其生物学意义目前还不清楚. Ye等[5]在研究55例乳腺癌及21例乳腺良性肿瘤中发现, mtDNA 4 977 bp缺失率为7.0%左右, 并表明其与临床病理学特征无关. Futyma等[6]对子宫内膜癌及癌旁组织的研究发现, mtDNA 4 977 bp缺失率分别为84%和81%, 其与绝经后妇女的子宫内膜癌有相关性. Dai等[7]在肺癌组织、肺正常癌旁组织及非癌患者正常肺组织中均检测出mtDNA 4 977 bp片段缺失率分别是54.1%, 59.5%, 30.0%, 缺失与年龄及吸烟相关. 在本研究中, 我们采用长距离PCR方法对50例CRC组织、50例相应的癌旁组织和20例正常结肠组织mtDNA 4 977 bp片段缺失进行了检测, 肠癌组织、癌旁正常组织及正常肠组织的mtDNA 4 977 bp缺失率均不高, 分别是10%, 18%, 15%, 癌旁组织缺失率高于癌组织. 与上述文献比较, 缺失率高的肿瘤早期肿瘤生长糖酵解能力高于氧化磷酸化, 无需太多线粒体支持, 细胞内线粒体生成受到抑制, 出现很多缺陷, 但肿瘤也能生长, 这种缺陷的线粒体蓄积多了, 细胞就会死亡, 所以可能是肿瘤早期的一种现象. 我们的数据提示: 大肠癌生长过程中氧化磷酸化能力起重要作用, 因此缺陷的线粒体相对少, 这可能是不同的肿瘤发生机制不同所引起的. 我们还发现缺失有随年龄增大而升高的趋势. 这些现象表明, 环境和年龄因素在mtDNA缺失突变的积累过程中可能起重要作用.

总之, 不同肿瘤中mtDNA 4 977 bp缺失率有明显不同, 目前的研究表明: 氧化磷酸化和糖酵解一样, 在肿瘤的生存和生长过程中起非常重要的作用. 因此, 那些含较高比例缺失突变的肿瘤细胞可能会因线粒体呼吸功能和ATP合成能力的降低而容易死亡. 许多研究者在肝癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤中发现肿瘤组织4 977 bp缺失率远低于相应的正常组织, 这也支持了以上的结论. 因此我们认为, mtDNA大片段缺失突变, 在癌变过程中不太可能起很重要的作用.

评论

背景资料

mtDNA突变目前已在胃癌、肺癌、食管癌和白血病等多种肿瘤及肿瘤细胞株中发现. 但有关mtDNA 4 977 bp缺失突变在细胞癌变中的作用及其生物学意义目前还不清楚.

同行评议者

李淑德, 主任医师, 中国人民解放军第二军医大学长海医院消化内科

研发前沿

线粒体是真核细胞的重要胞质细胞器, 随着对线粒体在细胞凋亡和诱发细胞癌变等肿瘤生物学过程中所起作用地进一步研究, mtDNA突变成为肿瘤研究的热点之一.

相关报道

Ye等在研究55例乳腺癌及21例乳腺良性肿瘤中发现, mtDNA 4 977 bp缺失率为7.0%左右, 并表明其与临床病理学特征无关.

应用要点

本研究发现mtDNA缺失率有随年龄增大而升高的趋势. 此现象表明, 年龄因素在mtDNA缺失突变的积累过程中可能起重要作用.

同行评价

本文探讨大肠癌组织中线粒体基因缺失突变与肿瘤生物学行为的关系, 有一定的临床意义.

备注

编辑:曹丽鸥 电编:何基才

参考文献

1.	Jakupciak JP, Maragh S, Markowitz ME, Greenberg AK, Hoque MO, Maitra A, Barker PE, Wagner PD, Rom WN, Srivastava S. Performance of mitochondrial DNA mutations detecting early stage cancer. BMC Cancer. 2008;8:285.  [PubMed]  [DOI]

2.	Schoser BG, Pongratz D. Extraocular mitochondrial myopathies and their differential diagnoses. Strabismus. 2006;14:107-113.  [PubMed]  [DOI]

3.	Meissner C, Bruse P, Mohamed SA, Schulz A, Warnk H, Storm T, Oehmichen M. The 4977 bp deletion of mitochondrial DNA in human skeletal muscle, heart and different areas of the brain: a useful biomarker or more? Exp Gerontol. 2008;43:645-652.  [PubMed]  [DOI]

4.	Fosslien E. Cancer morphogenesis: role of mitochondrial failure. Ann Clin Lab Sci. 2008;38:307-329.  [PubMed]  [DOI]

5.	Ye C, Shu XO, Wen W, Pierce L, Courtney R, Gao YT, Zheng W, Cai Q. Quantitative analysis of mitochondrial DNA 4977-bp deletion in sporadic breast cancer and benign breast diseases. Breast Cancer Res Treat. 2008;108:427-434.  [PubMed]  [DOI]

6.	Futyma K, Putowski L, Cybulski M, Miotla P, Rechberger T, Semczuk A. The prevalence of mtDNA4977 deletion in primary human endometrial carcinomas and matched control samples. Oncol Rep. 2008;20:683-688.  [PubMed]  [DOI]

7.	Dai JG, Xiao YB, Min JX, Zhang GQ, Yao K, Zhou RJ. Mitochondrial DNA 4977 BP deletion mutations in lung carcinoma. Indian J Cancer. 2006;43:20-25.  [PubMed]  [DOI]