病毒性肝炎 Open Access
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世界华人消化杂志. 2003-02-15; 11(2): 148-150
在线出版日期: 2003-02-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i2.148
丙型肝炎病毒锤头结构核酶的细胞内免疫
贾战生, 陈琳, 郝春秋, 冯志华, 李谨革, 王九平, 曹义战, 周永兴
贾战生, 郝春秋, 冯志华, 李谨革, 王九平, 周永兴, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心 陕西省西安市 710038
陈琳, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院呼吸内科 陕西省西安市 710038
曹义战, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院急诊科 陕西省西安市 710038
贾战生, 男, 1959-10-30生, 陕西省西安市人, 汉族, 副主任医师, 副教授, 医学博士. 中华医学会传染病与寄生虫病分会全国青年委员. 主要从事病毒性肝炎发病机制和基因治疗研究, 发表论文50篇, 获军队科技进步成果奖5项, 参与编写专著5部.
基金项目: 国家自然科学基金课题, No. 30070687; 全军医药卫生基金资助课题, No. 89D048.
通讯作者: 贾战生, 710080, 陕西省西安市灞桥区新寺路1号, 中国人民解放军第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心. jiazsh@fmmu.edu.cn
电话: 029-3377742 传真: 029-3537377
收稿日期: 2002-10-25
修回日期: 2002-11-01
接受日期: 2002-11-16
在线出版日期: 2003-02-15

目的: 探讨预先转染丙型肝炎病毒(HCV)核酶(Rz213)的人肝癌细胞对HCV再转染的抑制作用.

方法: 应用从前构建的HCV锤头结构Rz(Rz213), 通过脂质体介导的基因转染方法, 转染人肝癌细胞(HHCC), 经G418筛选转染Rz213的基因克隆, 应用luc报告基因的表达活性, 观察该细胞克隆对靶基因(pCMVNCR luc)转染的抑制作用.

结果: G418筛选能使 Rz213在转染细胞内有效表达Rz RNA, 转染Rz的多克隆细胞能有效地阻断靶基因的再转染.

结论: 我们构建的Rz213真核表达载体能在HHCC细胞内有效表达, 预先转染发挥细胞内免疫作用, 可防止HCV感染.

关键词: N/A
引文著录: 贾战生, 陈琳, 郝春秋, 冯志华, 李谨革, 王九平, 曹义战, 周永兴. 丙型肝炎病毒锤头结构核酶的细胞内免疫. 世界华人消化杂志 2003; 11(2): 148-150
Intracellular immunization by hammerhead ribozyme against HCV
Zhan-Sheng Jia, Lin Chen, Chun-Qiu Hao, Zhi-Hua Feng, Jin-Ge Li, Jiu-Ping Wang, Yi-Zhan Cao, Yong-Xing Zhou
Zhan-Sheng Jia, Chun-Qiu Hao, Zhi-Hua Feng, Jin-Ge Li, Jiu-Ping Wang, The Center of Diagnosis and Treatment of Infection Diseases of PLA, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Shaanxi Province, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Lin Chen, Department of Respiratory System, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Shaanxi Province, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Yi-Zhan Cao, Department of Emergency Medicine, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Shaanxi Province, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China
Supported by: the Scientific Foundation of Military Medicine, No. 89D048.
Correspondence to: Dr. Zhan-Sheng Jia The center of diagnosis and treatment of infection diseases of PLA, Tangdu Hospital, the Fourth Military Medical University, Shaanxi Province, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China. jiazsh@fmmuedu.cn
Received: October 25, 2002
Revised: November 1, 2002
Accepted: November 16, 2002
Published online: February 15, 2003

AIM: To evaluate the effect of hammerhead ribozyme 213 (Rz 213) against hepatitis C virus (HCV) infection.

METHODS: Rz213 cleaving 5'oncoding region (5'CR) of HCV was beforehand transfected in a human hepatic carcinoma cell (HHCC) line and selected for G418 resistance. Cells stably expressing Rz213 were retransfected with pCMVNCRluc containing 5扤CR-luc fusion genes by lipofectAMINE; luciferase activity in lysate of transfactant was measured in scintillation counter.

RESULTS: HHCC cells stably expressing Rz213 exhibited significant resistance to retransfection of targeting gene.

CONCLUSION: Stably transfected cells with Rz213 were selected and expressed in HHCC, and thus exerted the intracellular immunity against infection of HCV.

Key Words: N/A
0 引言

丙型肝炎病毒(HCV)非编码区(5'NCR)和核心(C)区高度保守, 具有重要的生物学功能, 是基因治疗选择的理想靶序列[1-5]. 锤头结构核酶(hammerhead Rz)分子较小, 结构简单, 易于体外设计合成, 已广泛用于抗病毒基因治疗研究[6-13]. 应用Rz基因转染技术作为细胞内免疫的工具, 由Baltimore at al首次提出, 并应用于艾滋病毒(HIV)的防治研究. Heusch at al 应用发夹(hairpin)结构核酶作为细胞内免疫分子, 预先转染人CEM/1细胞证明, 该细胞可以有效抵抗HIV病毒感染. 我们从前的研究结果表明, 以HCV 5'NCR为靶序列设计的锤头结构Rz, 可在细胞内有效地抑制靶基因的表达[10,14,15]. 本研究探讨了抗HCV 5'NCR核酶预先转染靶细胞的预防作用.

1 材料和方法
1.1 材料

人肝癌细胞株(human hepatic carcinoma cell, HHCC)由中科院上海细胞所细胞库引种, 本校863研究室保存. 核酶真核表达载体pcEM-Rz213 (Rz213)由本室自行设计构建, 并经测序体外切割证明[14]. 靶基因pCMVNCRluc含有HCV 5'NCR和C区66 nt, 并与luc基因融合, 由德国的Alt教授惠赠[1]. 转染方法按试剂盒说明操作(Lipofectamine和G418为Gibco产品).

1.2 方法

通过显微镜观察Rz转染对细胞生长特性的影响, 同时收集对数生长期细胞, 用胰酶消化, 尽可能消化成单个细胞悬液, 75 mL/L乙醇固定, 流式细胞仪检测细胞周期. 细胞转染Rz213 48 h后, 传代细胞(1:5)于6孔和24孔培养板内, 换用350 mg/L的G418完全培养液, 筛选转染细胞, 每3 d换培养液1次. 不同时间收集细胞, 制备裂解液. 留-部分做克隆筛选, 直至细胞克隆出现. 荧光素酶(Luc)活性检测按试剂盒说明操作(luciferase assay system 为 promega产品). 取20 μL 细胞裂解液, 加入1.5 mL Eppendorf管, 加100 uL luc测试液, 混匀; 尽快用液体闪烁计数仪计1 min的cpm值[15]. 同时用Braford法测定20 μL裂解液中的蛋白含量, 最后核算成每 mg蛋白所含的计数值.

统计学处理 数据均以均值加减标准差表示. 两组间比较采用t检验, 多组间比较采用方差分析.

2 结果
2.1 Rz转染对细胞的影响

将pcEM-Rz213转染的HHCC细胞多克隆(20 d), 传代取对数生长期细胞, 作细胞周期检测, 同时用转染空载体的HHCC细胞对照. 结果表明, 两组之间无显著意义, 说明Rz和载体在短期内对细胞的增生周期可能无影响.

2.2 G418筛选对Rz与luc基因共转染的影响

pCMVNCRluc为瞬时表达载体, 缺乏新霉素基因, 与pcDNA3共转染, 经G418筛选可明显延长luc的表达. 然而, 该载体与Rz213共转染, G418筛选提高了Rz基因的表达, luc活性并没有延长, 说明Rz基因在细胞内抑制了luc的表达. 靶基因组、Rz+靶基因组和对照组(空载体+靶基因)luc活性均随时间下降, 但在第5天时各组之间就有显著差异, 对照组最高, Rz组最低. 8 d后见Rz组luc活性明显低于对照组. 随G418筛选时间延长(最长20 d), 仅对照组可检测到luc活性, 但cpm值均在5 000以下, 远比前72 h低(图1).

图1
图1 G418筛选对Rz+luc基因共转染的影响.
2.3 pcEM-Rz213的细胞内免疫

Rz213与pCMVNCRluc靶基因共转染细胞, Rz213可有效地抑制luc的活性. 为了证明Rz对细胞的保护作用, 预先将pcEM-Rz213转染HHCC细胞, 经G418筛选抗性多克隆细胞. 以此为靶再用pCMVNCRluc 转染. 结果表明, 预先转染pcEM-Rz213的HHCC细胞可有效地阻断再转染靶基因的表达(图2).

图2
图2 pCMVNCRluc 在pcEM-Rz213 转染免疫细胞内的表达.
3 讨论

细胞内免疫包括细胞内抗体、DNA免疫、核酶和细胞因子基因转染等[16-21], 是抗病毒基因治疗的重要手段之一. 其主要步骤: 将目的基因转入靶细胞, 使靶细胞稳定表达某种抗病毒分子, 通过细胞内分子的作用, 有效地抑制病毒基因的表达和复制, 因此转入该基因的细胞能有效地抵抗病毒的攻击, 达到细胞内免疫的目的. Yu at al应用逆转录病毒为载体, 将抗HIV-1病毒的核酶基因转入胎儿脐血CD34+干细胞, 结果发现随细胞分化增生, 核酶基因仍有效表达, 转染目的基因的细胞可抵抗HIV-1病毒的感染. 最近, Fraisier et al[22]应用抗tat核酶和抗TAR的RNA诱饵联合细胞内免疫, 并在靶基因的3'端添加b-球蛋白的3'非编码序列, 增加了靶基因的稳定性, 有效地提高了抗HIV效果.

HCV感染者接受肝移植后, 发生移植肝再感染HCV是导致肝脏移植失败的主要原因[23]. 应用核酶技术, 采用HIV细胞内免疫的思路, 有可能防止移植肝再感染HCV. HCV核酶作为基因治疗的手段之一, 已经多位学者证明, 可有效地抑制病毒基因的表达[11,12,22-24]. 我们在研究了抗HCV Rz在细胞内抑制病毒基因表达的基础上, 探讨了该Rz预先转染肝细胞的细胞内免疫效应. 结果表明, 抗HCV 5'NCR Rz213预先转染的HHCC细胞, 可有效地表达Rz RNA分子, 经G418筛选的抗性多克隆细胞能够有效地抵抗靶基因的再转染. 提示将抗HCV Rz预先导入细胞, 有可能象HCV"疫苗"免疫-样, 防止HCV感染, 这对于慢性肝病晚期接受肝移殖的患者可能是一种新治疗希望, 预先将抗HCV Rz导入移殖的肝细胞, 以防止移殖肝再感染HCV.

基因治疗能否应用于临床, -方面取决于基因治疗的有效性, 另一方面由其对机体的副作用决定[25-27]. 抗HCV Rz载体介导的内源性Rz在细胞内有效表达是Rz清除病毒的基础. 借鉴体外切割实验的数据, Rz在细胞内要达到完全清除病毒, 其分子数必需是靶基因的100倍以上, 并要求Rz能到达所有HCV感染的肝细胞和非肝细胞[4,24]. 我们选择pcDNA3作为真核载体是-高效真核表达载体, 结果表明, 经G418抗性筛选可以提高Rz的表达. 细胞生长特性和细胞周期的研究表明, 该载体和Rz基因近期对靶细胞无毒副作用.

编辑: N/A

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