单细胞测序技术在结直肠癌中的研究进展

表1 单细胞基因组测序技术

方法	原理	优点	不足	参考文献
连接锚定型PCR	用蛋白酶K处理单细胞释放DNA, 用限制性内切酶将DNA切割成片段, 链接特异接头形成起始模版, 变性、退火和延伸进行循环扩增	高精度检测DNA拷贝数变异和基因位点变化; 降低序列选择偏好性	实验成本较高; 扩增效率和通量较	[23]
退变寡核苷酸引物PCR	使用含有退变序列的引物, 在低温退火阶段结合目标DNA的多个位点并启动扩增, 引物3'端包含特定序列, 可随机结合DNA, 通过多轮循环完成DNA扩增	降低区域偏好性; 适用于染色体CNV检测和基因克隆	随机引物设计可能造成效率低于特异性引物; 基因组覆盖率较低; 对低起始量DNA扩增偏差大	[24]
多重置换扩增	采用Phi29 DNA聚合酶和随机的六聚体引物在恒温条件下扩增DNA, 生成50-100 kb长片段	覆盖度和均匀性较好, 不同位点扩增偏差小于3倍; 适用于长片段DNA的高保真扩增, 操作简单	Phi29 DNA聚合酶昂贵且扩增时间长; 指数扩增可能导致偏倚、覆盖不均	[25]
转座子介导线性扩增	整合Tn5转座酶和T7RNA聚合酶实现单细胞基因组线性扩增. Tn5转座酶随机片段化DNA, T7启动子介导线性扩增, 通过逆转录和第二条链合成双链LIANT产物用于测序	扩增均匀性高; 减少扩增偏差; CNV检测精度高; 揭示细胞间变异	操作复杂; 存在C-T型假阳性突变	[26]
多重退火环状循环扩增	链置换活性DNA聚合酶生成半扩增子, 随机引物包含27个核苷酸序列和8个可变核苷酸的随机引物, 扩增子头尾互补成环状结构, 58 ℃退火进行扩增, 成环后采用PCR扩增	基因组覆盖率高(>95%)且覆盖深度≥1x; 敏感检测CNV和SNV	需严格控制温度和扩增步骤; 对实验操作环境要求高; 假阳性率高	[27]

LA-PCR: 链接锚定型PCR; DOP-PCR: 退变寡核苷酸引物PCR; MDA: 多重置换扩增; LIANTI: 转座子介导线性扩增; MALBAC: 多重退火状循环扩增; PCR: 聚合酶链式反应; CNV: 拷贝数目变异; SNV: 单核苷酸变异.