荜茇宁对急性胰腺炎大鼠干扰素-γ及硫氧还蛋白过氧化物酶-4基因的表达影响

摘要

目的: 探讨荜茇宁对胰腺组织硫氧还蛋白过氧化物酶-4(peroxiredoxin-4, Prdx-4)及炎症介质干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)表达的影响机制.

方法: 30只SD大鼠按数字表法随机分成假手术(S)组, 模型[重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)]组, 荜茇宁(P)组, 每组10只. 采用逆行胰胆管注射5%的牛黄胆酸钠(0.1 mL/100 g)建立SAP模型, SO组以生理盐水代替牛黄胆酸钠, P组于建模后立即将荜茇宁注入大鼠腹腔(5 mg/kg), 12 h后处死大鼠留取标本, 大鼠胰腺组织干燥箱烤至恒重后检测干湿比、荧光定量PCR检测Prdx-4 mRNA表达、HE染色观察病理学变化、紫外分光光度计检测血清淀粉酶(amylase, AMS)及ELISA法检测血清IFN-γ变化.

结果: 3组大鼠胰腺组织干湿比、血清AMS和IFN-γ浓度及胰腺组织Prdx-4 mRNA相对表达量比较, SO组和P组均比SAP组明显降低, 但P组比SO组增高, 差异均具有统计学意义(P<0.05); 病理评分P组比SAP组(3.86分±1.24分 vs 8.24分±1.67分, P<0.05)降低, 但较SO组高(P<0.05).

结论: 荜茇宁可降低SAP大鼠血清AMS和IFN-γ水平及下调胰腺组织中Prdx-4 mRNA表达量, 改善胰腺病理损伤, 推测荜茇宁可能通过抗炎作用改善SAP病情.

关键词: 急性胰腺炎; 荜茇宁; 干扰素-γ; 硫氧还蛋白过氧化物酶-4

核心提示: 本研究结果提示荜茇宁能通过影响血清干扰素-γ表达及胰腺组织中硫氧还蛋白过氧化物酶-4 mRNA表达, 减轻胰腺组织损伤, 下调血清淀粉酶水平, 对急性胰腺炎起一定保护作用.

Effect of piperlonguminine on expression of peroxiredoxin-4 gene in rats with acute pancreatitis

Xing-Yuan Chen, Yuan-Sheng Yang, Ken Chen, Li-Shu Chen, Wen-Rui Xie, Hui Wang

Xing-Yuan Chen, Ken Chen, Li-Shu Chen, Department of Internal Medicine, College of Clinical Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510310, Guangdong Province, China

Yuan-Sheng Yang, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University (Xinhai Hospital), Guangzhou 510300, Guangdong Province, China

Wen-Rui Xie, Department of Gastroenterology, the Frist Affiliated Hospital, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Hui Wang, School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Supported by: Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, No. 2012B060300029; Medical Scientific Research Foundation of Guangdong Province, No. B2012187; Department of Scientific Research Management of Guangdong Pharmaceutical University - The First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University United Natural Science Fund, No. GYFYLH201302; Project of Guangdong Provincial TCM Bureau of Traditional Chinese Medicine, No. 20151283.

Correspondence to: Ken Chen, Professor, Chief Physician, Department of Internal Medicine, College of Clinical Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, 68 Chigang Nanhua Avenue, Haizhu District, Guangzhou 510310, Guangdong Province, China. chenkenck@126.com

Received: October 13, 2015
Revised: October 31, 2015
Accepted: November 9, 2015
Published online: December 28, 2015

Abstract

AIM: To observe the effect of piperlonguminine on the expression of peroxidoxin-4 (Prdx-4) in pancreatic tissue and serum levels of inflammatory mediators.

METHODS: Thirty SD rats were randomly divided into a sham operated group (SO group), an SAP group and a piperlonguminine group (P group) with 10 rats in each group. A rat acute pancreatitis model was established by retrograde injection of 5% sodium tauroeholate (0.1 mL/100 g) into the biliopancreatic duct. Sodium tauroeholate was replaced with saline in the SO group. Piperlonguminine (5 mg/kg) was injected intraperitoneally in the P group after model development. The rats were sacrificed 12 h after operation, and pancreatic tissue samples were taken to detect the tissue wet/dry ratio, the expression level of Prdx-4 mRNA and histopathological changes. Serum levels of amylase (AMS) and interferon-γ (IFN-γ) were also measured.

RESULTS: The wet/dry ratio, AMS, IFN-γ and Prdx-4 mRNA in the SO group were significantly lower than those in the SAP group, but these indexes in the P group were significantly higher than those in the SO group (P < 0.05). The pancreatic histopathologic score in the P group was lower than that of the SAP group (3.86 ± 1.24 vs 8.24 ± 1.67, P < 0.05), but higher than that of the SO group (P < 0.05).

CONCLUSION: Piperlonguminine can not only reduce the levels of AMS, IFN-γ and Prdx-4 mRNA but also improve pancreatic pathological damage. Piperlonguminine alleviates pancreatitis via an anti-inflammatory effect.

Key Words: Acute pancreatitis; Piperlonguminine; Interferon-γ; Peroxiredoxin-4

0 引言

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)为临床常见危重疾病. 尽管目前临床对急性腺炎的诊疗水平不断提高, 但其总体死亡率仍达5%-10%, 其中重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)的死亡率高达36%-50%[1]. SAP时, 大量炎症细胞被过度激活并释放白介素-1(interleukin-1, IL-1)、IL-6、IL-10等炎症因子, 从而启动全身炎症反应[2,3]. 因此, 在SAP早期控制炎症反应, 能大大减轻胰腺损伤, 提高患者的生存率和改善预后. 近年研究[4-6]发现, 传统中药荜茇根部提取物茇宁通过调节活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)、部分凝血活酶时间和ERK-1/2信号通路等, 对脑神经损伤、抗凝血活性及脂多糖诱导的炎症反应等均有保护作用. 前期我们已进行的SAP后胰腺蛋白组学表达差异性研究, 发现硫氧还蛋白过氧化物酶-4(peroxiredoxin-4, Prdx-4)蛋白在SAP时表达量增多, 中药干预后下降[7]. 本实验围绕该课题前期研究结果, 应用中药荜茇宁处理SAP大鼠, 观察大鼠血清干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)和胰腺病理学等变化, 拟进一步探讨荜茇宁阻断Prdx-4蛋白表达作用, 及Prdx-4在SAP中作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料

30只健康成年的SD大鼠, 雌雄各半. 由广东省实验动物中心提供[SCXK(粤)2008-0018]. 按随机数字表法分成假手术(S)组、SAP组、荜茇宁(P)干预组, 每组10只; 牛黄胆酸钠(sigma, USA); 荜茇宁(Biovision, USA); 荧光定量仪(ABI); 酶标仪(BIO-RAD); 低温离心机(Labogene); 电热恒温培养箱(上海精宏).

1.2 方法

1.2.1 造模: 采用逆行胰胆管注射5%的牛黄胆酸钠(0.1 mL/100 g)建立大鼠SAP模型; P组大鼠在SAP建模后立予腹腔注射荜茇宁(5 mg/kg); 假手术大鼠以无菌生理盐水替代牛黄胆酸钠. 建模后12 h处死大鼠. 腹主动脉采血, 分离血清-70 ℃液氮冻存待测. 取部分新鲜胰腺在甲醛(40 g/L)中固定, 常规取材后, 用石蜡包埋, 最后将包埋组织切成4-5 μm厚的切片. 剩余胰腺-70 ℃液氮冻存待测干湿质量比值、Prdx-4 mRNA表达量.

1.2.2 相关指标测定: (1)胰腺干湿质量比测定 胰腺组织先称湿质量, 然后置80 ℃烤箱36 h烤干至恒质量, 测大鼠胰腺的干质量. 胰腺组织含水量 = (湿质量-干质量)/湿质量×100%; (2)血清淀粉酶含量测定: 按照南京建成生物工程研究所α-淀粉酶(amylase, AMS)测试盒说明书操作进行; (3)IFN-γ含量测定: 酶联免疫法ELISA, 按照欣博盛生物科技有限公司大鼠IFN-γ试剂盒说明书操作进行.

1.2.3 RT-PCR检测: 应用TRIzol提取SD大鼠胰腺组织RNA, 逆转录合成cDNA. 实时荧光定量PCR法检测胰腺组织中Prdx-4 mRNA的表达. R-Prdx4(扩增片段长度104 bp): 上游引物: 5'-GAGTGATGATCGGTTCCGGA-3'; 下游引物: 5'-GGAGTGATCTGCGACCGAAA-3'; R-GAPDH(扩增片段长度110 bp)内参基因: 上游引物: 5'-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3'; 下游引物: 5'-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3'. GAPDH和Prdx-4反应体系均20 μL, PCR反应条件均为: 95 ℃ 3 min, 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 95 ℃ 15 s, 40个循环.

1.2.4 胰腺病理检查: 胰腺组织放置40 g/L多聚甲醛中固定, 脱水石蜡包埋, 制成石蜡标本, 4 μm切片, 每1例均连续切片, 用于HE染色. 胰腺切片统一由3位病理科医师光镜下观察肺组织病理损害情况. 参照Kusske[8]按照水肿、感染、出血、坏死进行病理组织学评分. 每张切片计算5个视野, 分值之和为总评分, 取平均值进行统计分析.

统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行分析. 数据以mean±SD表示. 多组间比较运用单因素方差分析, 两两间比较采用LDS-t检验; 病理学评分采用Kruskal-Wallis H检验, 检验水准为α = 0.05, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 血清AMS和IFN-γ含量及胰腺干湿质量比

SO组血清AMS和IFN-γ含量及胰腺干湿质量比值较SAP组降低(P<0.05), P组血清AMS和IFN-γ含量及胰腺干湿质量比值较SAP组降低(P<0.05), 但P组较SO组增高(P<0.05)(表1).

表1 大鼠胰腺干湿质量比值、Prdx-4 mRNA表达量及血清AMS含量、IFN-γ含量测定 (n = 10, mean±SD).

分组	干湿质量比值	AMS(U/L)	IFN-γ(pg/mL)	Prdx-4 mRNA
SO组	3.303±0.218	1368.833±132.347	14.595±5.283	1.075±2.014
SAP组	4.40±0.192	4572.667±272.518	29.162±3.842	7.396±2.540
P组	4.03±0.025	3516.667±332.786	24.141±7.133	4.453±3.230
F值	65.845	236.898	4.541	1.999
P值	<0.000	<0.000	<0.048	<0.025

SO组: 假手术组; SAP组: 重症急性胰腺炎组; P组: 荜茇宁组; AMS: 淀粉酶; Prdx-4: 硫氧还蛋白过氧化物酶-4; IFN-γ: 干扰素-γ.

2.2 胰腺组织Prdx-4 mRNA含量

SO组胰腺组织Prdx-4 mRNA相对表达量较SAP组明显降低, P组血清Prdx-4 mRNA相对表达量较SAP组降低, 但P组较SO组增高(P<0.05)(表1).

2.3 胰腺病理结果

SO组病理评分为0, 各时间点可见胰腺小叶结构清晰, 胰腺细胞极性存在, 腺泡细胞的结构完整. SAP组病理评分为8.24分±1.67分, 可见大量炎症细胞浸润, 有不同程度的出血、坏死, 部分细胞出现核溶解甚至者消失, 残留的腺泡结构表现肿胀, 小叶间质水肿, 细胞极性消失. 而病理评分为3.86分±1.24分, 胰腺组织仅表现为腺泡肿胀, 散发坏死, 炎症浸润程度亦较SAP组轻, 治疗组的胰腺病理评分显著低于SAP组(P<0.05)(图1).

图1 各组大鼠胰腺病理学改变(HE×100). A: 假手术组; B: 12 h重症急性胰腺炎组; C: 荜茇宁处理后12 h重症急性胰腺炎组.

3 讨论

目前关于AP的发病机制尚不完全明确, 主要学说有: 胰腺自身消化学说、胰腺细胞内钙超载学说、炎症介质学说、细胞凋亡学说、肠道细菌易位学说等[9,10]. 诸多学者针对上述学说采用不同药物对SAP进行治疗, 如非肽类蛋白抑制剂、钙离子通道阻滞剂、氧自由基清除剂等. 近年来研究发现中医药治疗SAP有较好的前景. 荜茇是广泛应用于临床的中药, 荜茇宁是荜茇根部的提取物. 研究[4]表明, 荜茇宁能减少ROS的产生, 有保护神经元功能. 此外, 荜茇宁还具有抗血小板聚集, 降血脂, 抗黑素生成及抗高迁移率蛋白1(high mobility group box 1 protein, HMGB1)介导的炎症反应等[11,12]. 本研究发现, 荜茇宁干预后P组大鼠胰腺组织含水量、AMS水平较SAP组有明显下降(P<0.05). 光镜下观察, P组大鼠胰腺小叶结构完整性、间质水肿及炎症细胞浸润程度等虽较SO组严重, 但较SAP组轻, 进而证实了荜茇宁对SAP胰腺损伤具有保护作用.

炎症细胞和炎症介质在炎症疾病进程中有着关键作用, 这一观点已被公认. AP早期炎症反应主要与胰腺实质、胰周的巨噬细胞及中性粒细胞浸润有关, 其大量释放各种炎症介质, 引起胰腺损伤. 荜茇宁能抑制肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)和IL-6等炎症因子表达, 抑制核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)激活, 降低脂多糖诱导脓毒症的死亡率. 上述研究提示荜茇宁能通过抑制炎症因子表达, 对脂多糖诱导的炎症反应起保护作用[6]. 另一方面, Park等[13]发现炎症时TLR-4表达增加, TLR-4可作为HMGB1受体与HMGB1结合, 通过MyD88依赖性途径, 使TNF-α释放及NF-κB的移位, 最终导致炎症因子IFN-γ等大量表达. Ku等[12]研究提示, 荜茇宁能通过抑制HMGB1表达, 及抑制HMGB1介导的渗透性增高及白细胞迁移, 减轻炎症的严重程度. IFN-γ在免疫反应中起重要的调节作用, T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及单核巨噬细胞能产生大量的IFN-γ, IFN-γ能诱导NF-κB等炎症因子释放[14]. 本研究结果提示, 荜茇宁可下调SAP时IFN-γ的含量, 推测上述现象与荜茇宁通过抑制HMGB1表达, 减少HMGB1和TLR-4受体结合, 从而减少炎症因子表达有关.

Prdxs家属是一类具有过氧化氢酶活性的抗氧化蛋白, 广泛存在于原核生物和真核生物中. 其家族有6个成员, 分子量在22-27 kDa之间[15]. Prdx-4是该家族蛋白中唯一一个外分泌蛋白, 其主要分布于胰腺、肝脏、脑以及睾丸组织[16]. 由于Prdx-4属于外分泌蛋白, 其有望成为SAP的诊断标志物. Prdx-4不但能调节血栓素A2和表皮生长因子表达, 对NF-κB的表达也起重要调节作用[17]. 在炎症反应中, 抗原、有丝分裂素等能刺激、活化CD4⁺ Th、CD8⁺ T细胞、NK细胞巨噬细胞及B细胞等, 导致IFN-γ、IL-1β、NF-κB等炎症介质表达增加, 加重炎症反应[18]. Prdx-4能有效抑制T细胞的浸润, 预防B细胞产生ROS, 并及时清除过量的ROS, 减少炎症反应程度[16]. 本研究中, SO组胰腺组织Prdx-4 mRNA相对表达量较SAP组明显降低(P<0.05), P组胰腺组织Prdx-4 mRNA相对表达量较SAP组降低(P<0.05), 但P组较SO组增高(P<0.05). 总之, 我们考虑Prdx-4处于IFN-γ等炎因子介质激活通路下游, 当IFN-γ表达增加时, 能诱导下游Prdx-4表达增加并反馈性抑制T细胞浸润. 而给予荜茇宁处理后, 其抑制IFN-γ等炎介质表达, 从而导致Prdx-4基因激活减少, 进而使Prdx-4 mRNA相对表达量减少.

以上研究表明荜茇宁能下调AMS、IFN-γ含量, 减轻胰腺及全身炎症反应, 阻断AP的发生过程. 而炎症因子能激活Prdx-4基因表达, 表达增加的Prdx-4蛋白能负反馈抑制炎症因子, 在炎症反应用起到保护作用. 此外, 对于荜茇宁通过哪些机制抑制炎症反应, 以及Prdx-4与IFN-γ等炎症因子之间的信号通路关系, 仍有待我们进一步研究.

评论

背景资料

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是临床上一种常见的难治性消化系急腹症, 当前研究认为, 急性炎症反应是该疾病的重要发病机制.

同行评议者

陈光, 教授, 吉林大学第一医院消化器官外科

研发前沿

诸多学者针对不同发病机制学说采用不同药物对急性胰腺炎进行治疗. 近年来研究发现中医药治疗急性胰腺炎有较好的前景. 荜茇宁是中药荜茇根部的提取物. 研究表明, 荜茇宁有抗炎症反应作用. 对荜茇宁在急性胰腺炎中保护机制进行研究, 为荜茇宁应用于临床奠定基础.

相关报道

既往文献报道荜茇宁可能能成为治疗各种严重血管炎疾病的候选药物, 其保护机制可能通过抑制高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein, HMGB1)信号通路而对疾病产生一定影响.

创新盘点

本文以血清干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)含量及胰腺组织中硫氧还蛋白过氧化物酶-4(peroxiredoxin-4, Prdx-4)mRNA含量为切入点, 研究荜茇宁对大鼠急性胰腺炎病变保护的作用机制.

应用要点

抑制IFN-γ及Prdx-4 mRNA表达, 是荜茇宁治疗急性胰腺炎的机制之一.

名词解释

血清干扰素(IFN): 由英国科学家Isaacs于1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时首先发现的, 是一种细胞因子, 具有抑制细胞分裂, 调节免疫, 抗病毒, 抗肿瘤等多种作用. 其本质是蛋白质, 类型可分为α, β, γ, ω等几种. IFN能诱导细胞对病毒感染产生抗性, 是目前最主要的抗病毒感染和抗肿瘤生物制品.

同行评价

本研究设计合理、严谨, 内容新颖, 本研究发现荜茇宁能改善大鼠急性胰腺炎胰腺病理损伤, 荜茇宁可降低血清IFN-γ水平及下调胰腺组织中Prdx-4 mRNA表达量, 推测荜茇宁可能通过抑制炎症反应改善急性胰腺炎病情. 对胰腺炎的治疗等有一定价值.

备注

编辑:郭鹏 电编:闫晋利

参考文献

1.	Tenner S, Baillie J, DeWitt J, Vege SS. American College of Gastroenterology guideline: management of acute pancreatitis. Am J Gastroenterol. 2013;108:1400-1415, 1416.  [PubMed]  [DOI]

2.	Fagenholz PJ, Castillo CF, Harris NS, Pelletier AJ, Camargo CA. Increasing United States hospital admissions for acute pancreatitis, 1988-2003. Ann Epidemiol. 2007;17:491-497.  [PubMed]  [DOI]

3.	Huang H, Liu Y, Daniluk J, Gaiser S, Chu J, Wang H, Li ZS, Logsdon CD, Ji B. Activation of nuclear factor-κB in acinar cells increases the severity of pancreatitis in mice. Gastroenterology. 2013;144:202-210.  [PubMed]  [DOI]

4.	Wang H, Liu J, Gao G, Wu X, Wang X, Yang H. Protection effect of piperine and piperlonguminine from Piper longum L. alkaloids against rotenone-induced neuronal injury. Brain Res. 2015; Jul 29. [Epub ahead of print].  [PubMed]  [DOI]

5.	Lee W, Yoo H, Ku SK, Kim JA, Bae JS. Anticoagulant activities of piperlonguminine in vitro and in vivo. BMB Rep. 2013;46:484-489.  [PubMed]  [DOI]

6.	Lee W, Yoo H, Kim JA, Lee S, Jee JG, Lee MY, Lee YM, Bae JS. Barrier protective effects of piperlonguminine in LPS-induced inflammation in vitro and in vivo. Food Chem Toxicol. 2013;58:149-157.  [PubMed]  [DOI]

7.	杨 元生, 陈 垦, 叶 昇, 石 星亮, 杜 政委, 崔 淑兰, 王 晖. 清胰颗粒干预重症急性胰腺炎后胰腺蛋白组学表达差异性研究. 中国中西医结合杂志. 2013;33:60-67.  [PubMed]  [DOI]

8.	Kusske AM, Rongione AJ, Ashley SW, McFadden DW, Reber HA. Interleukin-10 prevents death in lethal necrotizing pancreatitis in mice. Surgery. 1996;120:284-288; discussion 289.  [PubMed]  [DOI]

9.	Song JM, Liu HX, Li Y, Zeng YJ, Zhou ZG, Liu HY, Xu B, Wang L, Zhou B, Wang R. Extracellular heat-shock protein 70 aggravates cerulein-induced pancreatitis through toll-like receptor-4 in mice. Chin Med J (Engl). 2008;121:1420-1425.  [PubMed]  [DOI]

10.	van Minnen LP, Blom M, Timmerman HM, Visser MR, Gooszen HG, Akkermans LM. The use of animal models to study bacterial translocation during acute pancreatitis. J Gastrointest Surg. 2007;11:682-689.  [PubMed]  [DOI]

11.	Ku SK, Kim JA, Bae JS. Piperlonguminine downregulates endothelial protein C receptor shedding in vitro and in vivo. Inflammation. 2014;37:435-442.  [PubMed]  [DOI]

12.	Ku SK, Kim JA, Bae JS. Vascular barrier protective effects of piperlonguminine in vitro and in vivo. Inflamm Res. 2014;63:369-379.  [PubMed]  [DOI]

13.	Park JS, Gamboni-Robertson F, He Q, Svetkauskaite D, Kim JY, Strassheim D, Sohn JW, Yamada S, Maruyama I, Banerjee A. High mobility group box 1 protein interacts with multiple Toll-like receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 2006;290:C917-C924.  [PubMed]  [DOI]

14.

Tamai R, Sugawara S, Takeuchi O, Akira S, Takada H. Synergistic effects of lipopolysaccharide and interferon-gamma in inducing interleukin-8 production in human monocytic THP-1 cells is accompanied by up-regulation of CD14, Toll-like receptor 4, MD-2 and MyD88 expression. J Endotoxin Res. 2003;9:145-153.  [PubMed]  [DOI]

15.	Neumann CA, Fang Q. Are peroxiredoxins tumor suppressors? Curr Opin Pharmacol. 2007;7:375-380.  [PubMed]  [DOI]

16.	Yamada S, Ding Y, Sasaguri Y. Peroxiredoxin 4: critical roles in inflammatory diseases. J UOEH. 2012;34:27-39.  [PubMed]  [DOI]

17.	Jin DY, Chae HZ, Rhee SG, Jeang KT. Regulatory role for a novel human thioredoxin peroxidase in NF-kappaB activation. J Biol Chem. 1997;272:30952-30961.  [PubMed]  [DOI]

18.	Schindler H, Lutz MB, Röllinghoff M, Bogdan C. The production of IFN-gamma by IL-12/IL-18-activated macrophages requires STAT4 signaling and is inhibited by IL-4. J Immunol. 2001;166:3075-3082.  [PubMed]  [DOI]