白介素-7对小鼠肝纤维化模型肝组织病理的影响

摘要

目的: 观察白介素-7(interleukin-7, IL-7)对小鼠肝纤维化模型肝组织病理的影响.

方法: 用CCl₄诱导形成小鼠肝纤维化模型. 将♀Balb/c小鼠18只随机分成3组, 每组6只, A组(生理盐水对照组); B组(纤维化模型组); C组(IL-7干预组). 造模4 wk末处死小鼠, 取肝组织肉眼及组织病理形态学法(常规HE染色、网状纤维染色及Masson染色)观察肝组织标本, 并采用Ishaki评分系统对小鼠肝组织炎症活动度及纤维化程度进行评分.

结果: 成功建立小鼠肝纤维化模型, 表现为汇管区周围纤维化明显, 有芒状纤维和纤维间隔形成, 组织病理: HE染色、网状纤维染色及Masson染色显示均显示C组与B组相比, 肝组织炎症及肝纤维化程度明显减轻, 肝脏坏死性炎症分级Ishaki评分A组(0-3分)6只; B组(7-9分)1只, (10-14分)2只, (15-18分)3只; C组(4-6分)1只, (7-9分)3只, (10-14分)2只; 3组炎症活动度得分有统计学差异(H_C = 14.14, P<0.01). 肝纤维化分期Ishaki评分A组中0分5只, 1分1只; B组4分2只, 5分2只, 6分2只; C组1分1只, 2分1只, 3分2只, 4分2只; 3组纤维化得分有统计学差异(H_C = 15.2, P<0.01).

结论: IL-7能够阻断CCl₄诱导的小鼠肝纤维化, 减轻肝脏炎症反应.

关键词: 白介素-7; 四氯化碳; 肝纤维化

核心提示: 白介素-7(interleukin-7, IL-7)是一种具有广泛效应的细胞因子, 其抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用常见报道. 近期研究也表明, IL-7在肺纤维化和肾脏纤维化中显露出潜在的治疗价值, 但其与肝纤维化的相关作用未见报道. 本实验通过建立动物肝纤维化模型, 观察IL-7对CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型肝组织病理的影响.

Influence of interleukin-7 on hepatic pathology in mice with liver fibrosis

Pei-Pei Liu, Cui-Yun Liu, Wen-Juan Fu, Dong-Shan Yu, Ming-Fa Chen, Jie Luo, Xue-Bing Yao, Wen-Na Xi, Zhen Gao, Shui-Lin Sun

Pei-Pei Liu, Cui-Yun Liu, Wen-Juan Fu, Dong-Shan Yu, Ming-Fa Chen, Jie Luo, Xue-Bing Yao, Wen-Na Xi, Zhen Gao, Shui-Lin Sun, Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Supported by: the Science and Technology Support Plan of Jiangxi Province Education Department, No. GJJ13164; the Foundation of Jiangxi Province Health Department, No. 20131068; the School Cooperation Projects of Science and Technology Plan of Nanchang City, No. 20121228.

Correspondence to: Shui-Lin Sun, Professor, Chief Physician, Department of Infectious Diseases, the Second Affiliated Hospital of Nanchang University, 1 Minde Road, Donghu District, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China. sunshuilin2280@126.com

Received: May 1, 2014
Revised: May 26, 2014
Accepted: June 6, 2014
Published online: July 28, 2014

Abstract

AIM: To observe the influence of interleukin-7 (IL-7) on hepatic pathology in mice with liver fibrosis.

METHODS: Hepatic fibrosis was induced in mice by subcutaneous injection of CCl₄. Eighteen female Balb/c mice were equally and randomly divided into three groups: a control group (A), a fibrosis model group (B) and an IL-7 intervention group (C). Four weeks after modeling, the mice were killed to observe liver tissues and pathological changes by HE staining, reticular fiber staining and Masson staining. The Ishaki scoring system was used to assess the severity of hepatic pathological changes.

RESULTS: Hepatic fibrosis was successfully induced with CCl₄, and significant fibrosis around the portal area and formation of spiky fibers and fibrous septa were observed. Hematoxylin-eosin staining, reticular fiber staining and Masson staining showed that compared to group B, liver fibrosis and inflammation in group C were relieved significantly. There were no inflammatory cells or fibers in group A. Based on the Ishaki scoring of the degree of inflammation, in group A 6 mice scored 0-3 points, 0 scored 4-6 points, 0 scored 7-9 points, 0 scored 10-14 points, and 0 scored 15-18 points; the corresponding figures were 0, 0, 1, 2, and 3 in group B and 0, 1, 3, 2, and 0 in group C. For hepatic fibrosis score, in group A 5, 1, 0, 0, 0, 0, and 0 mice scored 0 to 6 points, respectively, and the corresponding figures were 0, 0, 0, 0, 2, 2, and 2 in group B and 0, 1, 1, 2, 2, 0, and 0 in group C. There were significant differences in the degrees of inflammation and fibrosis between the three groups (P < 0.05).

CONCLUSION: IL-7 can mitigate hepatic fibrosis and relieve liver inflammation in mice with hepatic fibrosis.

Key Words: Interleukin-7; CCl₄; Hepatic fibrosis

0 引言

白介素-7(interleukin-7, IL-7)是一种具有广泛效应的重要细胞因子, 主要由骨髓和胸腺基质细胞分泌的一种糖蛋白, 在炎性过程中, 巨噬细胞, 树突细胞和成纤维细胞均可分泌IL-7[1], 其抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用常见报道. 近期研究也表明, IL-7在肺纤维化和肾脏纤维化疾病中, 已显露出其潜在的治疗价值, 但其与肝纤维化的相关作用与机制尚未见报道. 本实验通过建立动物肝纤维化模型[2], 观察IL-7对CCl₄诱导的小鼠肝纤维化模型的作用.

1 材料和方法

1.1 材料

清洁级健康♀Balb/c小鼠18只, 体质量20 g±2 g, 由南昌大学动科部提供; IL-7购自美国Chimerigen公司; 苏木精为进口分装; 伊红购自上海锐聪科技发展有限公司; 超高倍显微分析系统购自泰豪科技股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 动物分组和造模: ♀Balb/c小鼠18只, 实验前自由喂养1 wk, 随机分成正常对照A组(n = 6), 皮下注射生理盐水3 mL/kg, 2次/wk; 纤维化模型B组(n = 6), 皮下注射注射20%CCl₄(橄榄油稀释)3 mL/kg, 2次/wk; IL-7干预C组(n = 6), 造模同B组, 并肌肉注射IL-7 10 μg, 1次/d, 造模4 wk末处死小鼠, 小鼠处死前12 h禁食禁饮.

1.2.2 实验: 乙醚麻醉后, 分别取肝右叶小块组织用40 g/L甲酫固定, 石蜡包埋并切片用于检测项目.

1.2.3 病理组织学检查: 肝组织病理切片分别行HE染色观察肝组织病理变化, Masson染色观察Ⅰ型胶原增生程度, 网状纤维染色法观察Ⅲ型胶原增生程度, 病理组织学判定标准炎症活动度和纤维化程度判定标准参照2000-09修订的病毒性肝炎防治方案标准[3], 并采用Ishaki评分系统[4,5]分析, 每张切片随机选取5个视野, 分别记录炎症活动度分级和纤维化程度分期以及Ishaki评分. (1)HE染色: 经40 g/L甲酫固定, 石蜡包埋切片处理后制成4 μm厚连续切片6张, 切片面积约1 cm×1 cm, 常规HE染色; (2)特殊染色: 网状纤维染色、Masson染色; (3)Ishaki评分系统, 主要观察指标: 肝脏组织大体标本、病理形态、Ishaki评分来观察比较各组肝组织炎症活动度及各组肝组织纤维化程度;

统计学处理 实验数据用SPSS18.0统计软件分析, 采用统计学方法Kruskal-Wallis H检验, 对各个实验组数据进行分析处理, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 肝组织大体肉眼观察

对照组(A组)肝脏形态正常, 被膜光整、色泽红润、质地柔软; 模型组(B组)肝脏呈暗红色, 被膜粗糙, 颗粒较多, 质较硬, 出血较多; IL-7干预组(C组)肝脏被膜较B组光滑、颗粒较少、质较软、出血较少(图1).

图1 肝组织肉眼观. A: 正常组肝组织光滑细腻, 质柔软; B: 模型组肝组织粗糙, 质较硬, 出血较多; C: 干预组肝组织被膜较B组光滑, 质较软, 出血较少.

2.2 光镜下结果

A组HE染色汇管区未见炎症细胞浸润, 炎症活动度分级处于G0级; Masson染色和网状纤维染色汇管区未见纤维化, 纤维化程度分期处于S0期. B组HE染色汇管区广泛炎症细胞浸润, 可见点状坏死, 灶状坏死及碎屑状坏死, 并可见融合坏死, 炎症活动度分级处于G3级; Masson染色和网状纤维染色可见汇管区周围纤维化明显, 有芒状纤维和纤维间隔形成, 纤维化程度分期处于S3期. C组HE染色可见汇管区稍扩大, 炎症明显, 可见肝细胞变性, 点状坏死及灶状坏死, 炎症活动度分级处于G2级; Masson染色和网状纤维染色可见汇管区周围纤维化, 纤维间隔形成, 小叶结构保留, 纤维化程度分期处于S2期(图2, 图3和图4).

图2 肝组织HE染色(×100). A: 正常对照组; B: 纤维化模型组; C: 白介素-7干预组.

图3 肝组织Masson染色结果(×100). A: 正常组织, 无纤维沉积; B: 模型组汇管区纤维结缔组织增生, 纤维间隔形成伴小叶结构紊乱; C: 白介素-7干预组汇管区纤维结缔组织增生, 少量纤维间隔形成, 小叶结构完整.

图4 肝组织网状纤维染色(×100). A: 正常组织, 无纤维沉积; B: 模型组汇管区纤维结缔组织增生, 纤维间隔形成伴小叶结构紊乱; C: 白介素-7干预组汇管区纤维结缔组织增生, 少量纤维间隔形成, 小叶结构完整.

2.3 Ishaki评分的统计分析

A组、B组、C组3组之间Ishaki炎症及纤维化评分的实验数据采用完全随机设计多样本比较的Kruskal-Wallis H检验分别对以上评分进行统计后得出肝脏炎症活动度H_C = 14.14, P<0.01; 肝纤维化程度H_C = 15.2, P<0.01. 因此各组在肝脏炎症活动度及肝纤维化程度间差异均具有统计学意义(图5).

图5 Ishaki评分. A: 坏死性炎症评分, Kruskal-Wallis H检验H_C = 14.14, P<0.01; B: 纤维化评分, Kruskal-Wallis H检验H_C = 15.2, P<0.01. 1: 对照组; 2: 模型组; 3: 白介素-17干预组.

3 讨论

肝纤维化一切慢性肝病的共同病理基础, 其实质是肝脏内纤维结缔组织增生, 肝内细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成大于降解导致大量ECM过度沉积[6]. 肝纤维化是慢性肝病的共同病理基础, 其病因大致可分为感染性(病毒性肝炎、血汲虫病等), 先天性代谢缺陷(肝豆状核变性、α1-抗胰蛋白酶缺乏症等)、化学代谢缺陷(慢性酒精性肝病、慢性药物性肝病)、自身免疫性肝病、原发性肝汁性肝硬化及原发性硬化性胆管炎等. 肝纤维化是一个可逆性病理过程, 其中25%-40%最终发展为肝硬化甚至肝癌[7,8], 严重危害人们身心健康. 临床上对肝纤维化缺乏较好的治疗手段, 如能寻求一种有效的抗纤维化药物或方法, 及时阻断、逆转肝纤维化将为临床上各种肝纤维化患者带来希望的曙光. 因此, 深入开展抗纤维化研究, 对于我国防治肝纤维化有着重要的意义. 在目前的抗纤维化研究中, 陆续出现的一些抗纤维化药物, 包括化学药物、生物制剂等, 如干扰素、拉米夫定、秋水仙碱、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂、肝细胞生长因子, 能够在一定程度上抑制肝纤维化[9-11], 但因毒性过大或抗纤维能力有限而在临床上应用受到限制. 因此, 寻找一种安全有效的抗纤维化药物在现阶段尤显迫切.

IL-7是一种具有广泛效应的重要细胞因子, 其抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用多有报道. Pellegrini等[12]在感染淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒的小鼠体内研究发现, IL-7能促进肿瘤坏死因子、干扰素(interferon)-β/γ、IL-6和IL-22分泌, 降低转化生长因子-β(transforming growth factor beta, TGF-β)水平, 增强对肝细胞的保护作用, 并促进CD8+和CD4+ T细胞增殖, 遏制细胞因子信号转导抑制因子-3通路, 提高病毒特异性CD8⁺ T细胞清除病毒的能力. Tachibana等[13]报道应用多黏菌素B包被纤维柱(PMX-DHP)血液灌注疗法治疗特发性肺纤维化急性加重期(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)患者, 血清IL-7显著升高, 提示IL-7将可能具有抗纤维化作用, 并可能作为应用PMX-DHP治疗IPF的血清学预测指标. Huang等[14]发现IL-7可通过上调Smad7而非依赖INF-γ途径来抑制TGF-β的分泌, 从而减轻博莱霉素诱导的肺纤维化. Zhang等[15]亦证实IL-7能抑制TGF-β诱导的蛋白激酶C-δ磷酸化过程, 积累Smad7, 抑制胶原蛋白的合成从而抑制肺纤维化的形成. Hsieh等[16]发现IL-7能促进受高糖环境抑制的人肾小管上皮细胞增殖, 并抑制高糖诱导的纤连蛋白、TGF-β等因子的分泌, 提示IL-7参与上皮-间质转化信号通路来抑制肾近端小管的纤维化. 以上研究表明, IL-7具备抗纤维化功能, 但IL-7对肝纤维化的作用如何, 未见报道, 为此本课题就IL-7与肝纤维化的作用进行了深入细致的研究.

本实验发现, 造模4 wk的肝脏组织肉眼外观及光镜下病理炎症和纤维化评分发现正常对照组(A组)、纤维化模型组(B组)和IL-7干预组(C组)3组中存在显著的差异, 各组之间的差异有统计学意义(P<0.05); 从肉眼观察到, A组肝脏形态正常, 被膜光整、色泽红润、质地柔软; B组肝脏呈暗红色, 外观粗糙, 颗粒较多, 质较硬, 出血较多; C组肝脏外观较B组光滑, 颗粒较少, 质较软, 出血较少. 从肝组织病理常规HE染色观察到, A组汇管区未见炎症细胞浸润, 炎症活动度分级处于G0级; B组汇管区广泛炎症细胞浸润, 可见点状坏死, 灶性坏死及碎屑状坏死, 并可见融合坏死, 炎症活动度分级处于G3级; C组介于两组之间, 炎症程度较B组减轻, 其汇管区稍扩大, 炎症明显, 可见肝细胞变性, 少量点状坏死及灶状坏死, 未见明显融合坏死, 炎症活动度分级处于G2级; B组Masson染色和网状纤维染色可见汇管区周围纤维化明显, 可见大量粗且长的网状纤维、胶原纤维以及纤维间隔形成, 纤维化程度分期处于S3期; C组Masson染色和网状纤维染色显示其纤维化程度较B组显著减轻, 纤维组织细少, 纤维化程度分期处于S2期; A组未见明显纤维沉积, 纤维化程度分期处于S0期. 进一步采用Ishaki评分系统定量分析: 肝脏炎症评分示A组小鼠得分多在(0-3分), B组多为14-16分, C组多为(7-9分), 且3组比较肝脏炎症活动度得分差异具有统计学意义(H_C = 14.14, 均P<0.01), 干预组的炎症较模型组明显减轻, 差异显著; 肝脏纤维化评分示A组小鼠得分多为(0-1分), B组多为(5-6分), C组多为(2-3分), 且3组比较肝脏纤维化得分差异具有统计学意义(H_C = 15.2, P<0.01), 干预组的纤维化程度较模型组明显减轻, 差异显著. 上述实验结果提示IL-7能明显减缓CCl₄诱导的小鼠肝纤维化的程度, 减轻肝脏炎症, 有明显的抗纤维化的作用.

总之, IL-7能够阻断CCl₄诱导的小鼠肝纤维化, 减轻肝脏炎症反应.

评论

背景资料

目前的抗肝纤维化的药物能够在一定程度上抑制肝纤维化, 但因毒性过大或抗纤维能力有限而在临床上受到限制. 在肺纤维化和肾脏纤维化疾病中, 白介素-7(interleukin-7, IL-7)已显露出其潜在的治疗价值, 开展IL-7在肝纤维化疾病中的研究将具备重要的价值.

同行评议者

吴江锋,教授, 三峡大学医学院形态学部

研发前沿

IL-7在肺纤维化及肾纤维化近期研究中已崭露头角, 抗纤维化机制也日趋明朗, 目前抗肝纤维化药物仍不尽满意, IL-7能否具有抗肝纤维化作用值得研究.

创新盘点

近期研究发现IL-7对肺纤维化和肾纤维化有影响, 而对肝脏纤维化的作用如何尚未见报道. 鉴于各个器官纤维化发生机制具有相似性, 因此, 本课题拟在建立小鼠肝纤维化模型的基础上, 观察IL-7对小鼠肝纤维化模型肝组织病理的影响.

应用要点

本研究发现IL-7与肝纤维化关系密切, IL-7能够阻断CCl₄诱导的小鼠肝纤维化, 减轻肝脏炎症反应, 为进一步开展IL-7的相关研究及临床应用提供理论依据.

同行评价

本文立意新颖, 具有一定指导意义.

备注

编辑 田滢 电编 闫晋利

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