ATP酶在细菌潜生体相关的IBS大鼠模型肠黏膜中的变化

摘要

目的: 研究细菌潜生体相关的肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)大鼠模型肠黏膜ATP酶的变化.

方法: Wistar大鼠分为正常对照组和细菌潜生体相关的IBS大鼠模型组. 采用无机磷法检测大鼠回盲部黏膜ATP酶活性, 高效液相色谱法检测回盲部黏膜细胞的腺苷酸能荷及ATP与总腺苷酸库比值, MTT法检测回盲部黏膜呼吸酶活性. 

结果: 与正常对照组相比较, IBS大鼠模型组回盲部肠黏膜Na⁺-K⁺-ATP酶(22.44±5.54 vs 14.20±3.03, P<0.01), Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶均显著下降(16.46±1.86 vs 10.63±1.78, P<0.01), ATP显著降低(0.96±0.18 vs 0.48±0.20, P<0.01), 同时呼吸酶活性显著变化(0.50±0.07 vs 0.21±0.05, P<0.01). 

结论: IBS大鼠回盲部黏膜ATP酶活性显著降低, 与能量代谢降低相关, 这可能是引起肠黏膜屏障功能受损的重要原因, 与IBS病因相关.

关键词: Na⁺-K⁺-ATP酶; Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶; 肠易激综合征; 回盲部; 黏膜

Changes of intestinal mucosa ATPase in the bacterial cryptic growth cell-related IBS rat model

Yi-Jin Pei, Mei Huang, Lin-Ming Guo, Xiao-Lan Wu, Jun-Kang Liu

Yi-Jin Pei, Mei Huang, Lin-Ming Guo, Xiao-Lan Wu, Jun-Kang Liu, Bio-Wave Research Center, Department of Laboratory Medicine, the Third Military Medical University of Chinese PLA, Chongqing 400038, China

Supported by: the Natural Science Planning Foundation of Chongqing Science and Technology Committee, No. CSTC2006BB5068.

Correspondence to: Jun-Kang Liu, Bio-Wave research center, Department of Laboratory Medicine, the Third Military Medical University of Chinese PLA, Chongqing 400038, China. liujunkang@163.com

Received: January 5, 2009
Revised: February 13, 2009
Accepted: February 16, 2009
Published online: March 18, 2009

Abstract

AIM: To study the ATPase changes of intestinal mucosa of the bacterial cryptic growth cell (CGC)-related irritable bowel syndrome (IBS) rat model.

METHODS: Wistar rats were divided into normal control group and the bacterial CGC-related IBS rat model group. The ATPase activity in rat ileocecal mucosa was tested by inorganic phosphorus detection method, the energy charge (Ec) of adenosine triphosphate and the ratio of ATP to the total amount of adenylic acid pool in ileocecal mucosa cells were detected by high performance liquid chromatography method, and the respiratory enzyme activity was tested by MTT assay method.

RESULTS: Compared with normal control group, in IBS rat model group intestinal mucosa Na⁺-K⁺-ATPase (22.44 ± 5.54 vs 14.20 ± 3.03, P < 0.01), and Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase (16.46 ± 1.86 vs 10.63 ± 1.78, P < 0.01) were significantly decreased, and ATP content was also significantly lower (0.96 ± 0.18 vs 0.48 ± 0.20, P < 0.01), accompanied by the respiratory enzyme activity changes (0.50 ± 0.07 vs 0.21 ± 0.05, P < 0.01).

CONCLUSION: Lower ATPase activity in IBS rat ileocecal mucosa is relevant to lower energy metabolism, which may cause damage to mucosal barrier function. The results have significance on the IBS pathogenesis and treatment.

Key Words: Na⁺-K⁺-ATPase; Ca²⁺-Mg²⁺-ATPase; Irritable bowel syndrome; Ileoceca; Mucosa

0 引言

肠易激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一种在人群中发生率较高[1], 严重影响人们生活质量的持续存在或间歇发作的肠道功能性疾病, 但其病因复杂和发病机制尚不完全清楚, 造成其防治治疗的困境[2]. ATP酶存在于组织细胞及细胞器膜上, 是生物膜上的重要蛋白酶, 在物质运送、能量转换及信息传递等方面均有重要作用, 已有研究证实在某些病理条件下[3]及机体缺氧时[4], ATP酶会发生一系列的改变, 已成为早期生理功能衰退的敏感指标. 但是, 迄今为止, 甚少IBS动物模型肠黏膜ATP酶活性的相关报道. 细菌潜生体(cryptic growth cell, CGC)相关的IBS动物模型是最近新建立的一种较为理想的IBS动物模型, 已初步证实代谢缓慢, 菌体延长, 侵袭能力强的CGC与IBS发病相关[5]. 刘俊康 et al[6]在前期工作中研究证实该模型的回盲部三个肠段的细胞线粒体能荷值以及ATP与总腺苷酸库比值均有明显变化. 本文以该模型为研究对象, 进一步研究了CGC易定植的整个回盲部肠黏膜ATP酶活性及能量代谢水平, 以期阐明这些指标与IBS发病机制的关系.

1 材料和方法

1.1 材料

清洁级Wistar大鼠, 雌雄各半, 体质量200±20 g, 购自中国人民解放军第三军医大学动物研究所. 全价颗粒饲料饲养, 自由饮水, 12 h 1次明暗周期交替, 室温24℃, 相对湿度45%-60%. ATP酶测试试剂盒: 南京建成生物工程研究所产品; 头孢呋辛钠, 葛兰素史克集团生产; 辣椒, 市售; MTT试剂, Sigma公司产品; KM₂O₄, K₂CO₃, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, HCLO₄等均为分析纯; 其余试剂染液固定剂, 市售, 常规配制. 光学显微镜, XS2-4G, 重庆光学仪器厂; 高速离心机, TGL-16G, 上海医用分析仪器厂; 高效液相色谱仪, 1100Agilent, 美国安捷仑公司; 酶标仪, BioRad550, 美国BioRad公司; 紫外分光光度计, Du800, 美国Beckman Culter公司.

1.2 方法

1.2.1 细菌CGC相关的IBS模型建立: 参照文献[5], 略有修改. Wistar大鼠经适应性饲养后, 随机取20只Wistar大鼠, 常规饲养, 作为正常对照组. 另取60只Wistar大鼠, ip头孢呋辛钠2 g/L, 每2 d 1次0.2 mL, 连续3次, 然后再注射5 g/L头孢呋辛纳, 每次1 mL, 同时检测粪便细菌CGC情况[7], 将粪便标本连续3次检测到细菌CGC的大鼠挑选出来进行辣椒液刺激实验. 7 d后给辣椒水(100 g干辣椒加水1000 mL煮至500 mL)刺激, 连续3 d灌胃总量为大鼠体质量的1/8, 此时粪便含水量经检测显著增高[8]的大鼠即为实验需要的IBS模型大鼠. 从中随机选取20只进行下一步检测.

1.2.2 大鼠腺苷酸能荷及ATP与总腺苷酸库比值的测定: 分别取正常对照和IBS模型大鼠各10只, 断颈处死, 立即剪取回盲部, 于冰冷的生理盐水中洗净, 取黏膜层, 立即加入9倍0℃的分离介质(0.25 mol/L蔗糖, 10 mol/L的Tris-HCl, 0.5 mol/L的EDTA)匀浆, 然后在1250 g离心8 min, 取上层液体, 5000 g离心10 min, 取沉淀; 再加入适量分离介质, 混匀后5000 g离心10 min, 弃上清液, 如此清洗数次后得到较纯的线粒体, 另取1 mL分离介质加入, 振匀, 得线粒体悬液. 从中取0.2 mL加入到0.4 mL 1.6 mol/L的HClO₄中, 0℃静置5 min后, 12500 g离心15 min, 取上清液, 加入适量的2.5 mol/L的K₂CO₃溶液至液体呈中性(pH6.5). 然后0℃静置10 min, 再次12500 g离心15 min, 取上清液, 用于高效液相色谱仪检测, 色谱条件: 检测波长254 nm, 碳十八色谱柱, 流动相为pH6.0磷酸缓冲液, 流速1 mL/min, 柱温37℃, 进样量10 µL[9].

1.2.3 大鼠肠黏膜Na⁺-K⁺-ATP酶, Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性测定: 取正常对照和IBS模型大鼠各10只, 断颈处死, 立即取回盲部, 生理盐水中洗净, 取黏膜层, 按重量体积比加9倍生理盐水匀浆, 离心后取上清液用于检测Na⁺-K⁺-ATP酶, Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性.

按试剂盒说明书操作进行, 无机磷法测定Na⁺-K⁺-ATP酶, Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶活性, 以每小时每毫克组织蛋白的组织中Na⁺-K⁺-ATP酶, Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶分解ATP产生1 µmol/L无机磷的量为一个ATP酶活力单位即µmol Pi/(mg prot·h), 考马斯亮蓝法测定组织蛋白含量.

1.2.4 MTT法检测大鼠肠黏膜活性水平: 大鼠颈椎脱臼处死, 无菌解剖, 取各组大鼠回盲部, 生理盐水中洗净内容物和表层黏液后, 分别用金属钝器刮取黏膜层, 用含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640调整细胞浓度为2×10⁹/L, 按100 µL加入96孔培养板中, 于50 mL/L CO₂, 37℃培养箱中培养24 h. 用MTT法检测细胞活性, 用Bio-Rad550型酶标仪于570 nm处测吸光度A值, 结果以A₅₇₀值表示.

统计学处理 所有计量资料用mean±SD表示, 使用SPSS13.0统计软件进行t检验及方差分析结果.

2 结果

2.1 大鼠回盲部黏膜线粒体能量产生情况

根据公式: 能荷EC = (1/2ADP⁺ATP)/(AMP⁺ADP⁺ATP), ATP与总腺苷酸库比值 = ATP/(AMP⁺ADP⁺ATP), 计算大鼠回盲部黏膜线粒体能荷和ATP与总腺苷酸库比值. 与对照相比, IBS模型大鼠能荷值, ATP与总腺苷酸库比值, ATP均显著下降(P<0.01, 表1).

表1 大鼠回盲部黏膜线粒体能量产生情况 (mean±SD, n = 10).

分组	ATP	ADP	AMP	能荷(EC%)	ATP与总腺苷酸库比值(%)
正常对照组	0.96±0.18	1.50±0.42	0.83±0.16	52.2±0.02	29.6±0.03
IBS模型鼠	0.48±0.20b	1.41±0.60	0.74±0.30	43.8±0.04b	17.5±0.02b

^bP<0.01 vs 正常对照大鼠.

2.2 大鼠回盲部黏膜ATP酶的变化

与对照相比, IBS模型大鼠回盲部黏膜Na⁺-K⁺-ATP酶, Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶均显著下降(P<0.01, 表2).

表2 大鼠回盲部黏膜ATP酶变化 (mean±SD, n = 10).

分组	Na+-K+-ATPase		Ca2+-Mg2+-ATPase
正常对照组		22.44±5.54	16.46±1.86
IBS模型鼠		14.20±3.03b	10.63±1.78b

^bP<0.01 vs 正常对照大鼠.

2.3 大鼠回盲部黏膜细胞的呼吸酶活性

MTT检测结果显示, 正常对照组A570值与IBS模型组相比较有显著差异(0.50±0.07 vs 0.21±0.05, P<0.01).

3 讨论

本研究首次发现, 细菌CGC相关的IBS模型回盲部黏膜的Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶均有显著降低, 意味着IBS大鼠回盲部黏膜ATP酶活性受到影响, 同时肠黏膜上皮细胞呼吸酶活性低下和作为机体能量的ATP也有显著下降, 这些现象是相关的. ATP酶进行逆化学梯度离子转运, 是一种主动耗能过程, 需要水解ATP释防能量, 而IBS模型大鼠ATP下降, 能量供给匮乏, 会影响到ATP酶功能, ATP酶活性下降, 导致过多离子如Ca²⁺积聚在线粒体, 干扰线粒体氧化磷酸化, 线粒体不能正常发挥功能, 影响ATP生成, 使能量生成更趋减少, 会导致ATP酶活性进一步下降. 在IBS模型大鼠中发现ATP酶活性下降具有重要的生理意义, 对阐明IBS发生及防治有积极意义的, 我们认为早期使用对ATP酶活性有上调作用的药物, 对于及时早期治疗有帮助.

自IBS被发现以来, 对他的认识经历了许多变迁. IBS作为一种功能性疾病, 所有的症状与特定的结构, 内视镜或组织学上的异常没有相关性[2]. 然而, 近来陆续有报道证实如PD-IBS肠通透性改变, 肠黏膜屏障功能缺损[10]. IBS模型大鼠肠黏膜上皮细胞呼吸酶活性低下和ATP含量降低, 提示肠黏膜上皮细胞受到影响正是肠黏膜屏障功能缺损的决定因素. 我们分析原因在于, 细胞ATP酶活性显著下降, 细胞内外离子浓度梯度受到影响, 会造成离子流紊乱, 胞质内如Ca²⁺离子积累, 能量代谢水平降低, 进一步引起亚细胞结构的改变, ATP酶改变可能是肠黏膜屏障功能受损的重要原因, 提示为引发 IBS症状的原因.

愈来愈多的证据显示微生物与IBS密切相关, 如IBS患者小肠细菌过度生长[11-12], 肠道菌群失调[13-14]等, 细菌感染后部分患者易形成IBS症状[15-16]等. 在我们所用的IBS模型大鼠粪便中可持续检出有CGC, 而且回盲部有CGC的定植物[5]等, 也进一步的证实微生物与IBS密切相关. ATP酶是镶嵌在脂质双分子层的特殊蛋白, 亚基暴露在细胞膜表面, 易受种种影响, 在我们所用的IBS模型大鼠CGC的定植和自溶导致内毒素产生[5], 推测细菌内毒素的产生与该部位的ATP酶活性下降有关联, 相关的实验正在进行中.

评论

背景资料

国际上对IBS的研究除继续关注5-HT受体相关的作用机制外, 出现了一部分肠黏膜屏障功能改变的研究. 本文针对屏障中最为重要的细胞功能改变进行了探讨.

同行评议者

杜群, 副研究员, 广州中医药大学脾胃研究所药理室

研发前沿

肠黏膜屏障研究多是探讨外来因素, 如肠道细菌毒素或肥大细胞等释放的过敏介质作用下屏障改变; 甚少直接研究IBS中构成肠黏膜屏障之间的上皮细胞的改变, 成为该领域亟待解决的问题.

创新盘点

本文研究结果表明在IBS模型大鼠肠回盲部, 其黏膜上皮细胞的Na⁺-K⁺-ATP酶和Ca²⁺-Mg²⁺-ATP酶的活性均降低, 这有助于说明IBS中肠黏膜屏障功能改变的细胞学功能基础.

应用要点

本研究有助于围绕这两个酶作为靶位的药物开发及其治疗作用机制阐明, 也有助于阐明IBS发病的机制.

同行评价

本文工作基础好, 方法较先进, 有较好的科学意义.

备注

编辑:李军亮 电编:何基才

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